免疫组化的原理与操作.ppt

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(2)双桥法在三抗之后,将二抗和三抗再重复一次,可增大染色强度。★特别提示:注意动物种属关系特点:敏感性高,但酶浓度不好掌握;与组织非特异性结合的酶不易洗去,背景染色重。第21页,共39页,2024年2月25日,星期天4.过氧化物酶—抗过氧化物酶法(Peroxidaseanti-peroxidasemethod,简称PAP法)是桥法的改良,用第二抗体作“桥梁”,先与第一抗体结合,再与PAP复合物联结,形成抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物,最后用底物显色剂显色。特点:灵敏度高,比间接荧光法敏感20倍,比间接酶标记抗体法敏感100倍第22页,共39页,2024年2月25日,星期天5.亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique,简称ABC法)。关键的程序步骤为3步:Ag+Ab1+(Ab2-B)+AB★C复合物(Ab2-B为生物素标记的第二抗体)(B★为生物素标记的过氧化物酶)AB★C复合物是avidin与酶联biotin在使用前30min配置,混匀。1个avidin分子结合了3个biotin分子,剩下1个结合点与2抗的生物素结合,avidin起桥联作用。第23页,共39页,2024年2月25日,星期天(1)ABC复合物的制备:(2)ABC法反应原理:特点:ABC法敏感性更高,比PAP法敏感20~40倍,背景也更清晰。第24页,共39页,2024年2月25日,星期天ABC法示意图第25页,共39页,2024年2月25日,星期天染色结果观察(BrdU)第26页,共39页,2024年2月25日,星期天6、酶标亲和素-生物素技术(labelledavidin-biotintechnique,简称LAB法)。即用辣根过氧化物酶直接标记avidin,用biotin标记2抗。关键步骤为3步:Ag+Ab1+(Ab2-B)+A★(A★为HRP标记的卵白素)A★与2抗的生物素结合,avidin起桥联作用。如将该法中的卵白素(avidin)变换成链霉卵白素(streptavidin),LAB法即成LsAB法,或称SP法。据认为LAB法比ABC法敏感2~4倍,而LsAB法因链霉卵白素不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在SP法已趋于取代ABC法而广为应用。第27页,共39页,2024年2月25日,星期天生物素化Ⅱ抗AB复合物酶标链卵白素AvidinBiotinPeroxidaseⅠ抗组织抗原ABC法(3步完成)LsAB(SP)法(3步完成)第28页,共39页,2024年2月25日,星期天链霉卵白素酶生物素底物抗原SP法示意图第29页,共39页,2024年2月25日,星期天(二)免疫组化染色步骤(以ABC法为例)

1)、切片常规脱蜡至水:二甲苯虽然可以反复使用,但次数不宜多。乙醇的浓度是从高到低,与脱水时相反。

2)、灭活内源性酶:博士德推荐应用3%的双氧水,但实际操作中,使用30%双氧水和纯甲醇按1:9的溶剂比混合较为理想。

3)、抗原修复:暴露被交联封闭的Ag。

4)、正常山羊血清封闭:封闭时应该注意室温与时间的相对关系。室温低,时间就要长一些,反之亦然。另外,保持反应池湿润是重要的一环,否则,前功尽弃。后面的步骤也是如此。

5)、一抗反应:一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度与背景有直接关系。一般说来,阳性染色强度不够时,可提高一抗浓度和延长孵育时间;背景过高时则相反。

孵育时间与温度:抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关键。因此,控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温控制较为困难,建议4℃冰箱过夜(≥18h)。第30页,共39页,2024年2月25日,星期天6)、二抗(生物素化IgG)反应:建议湿盒内37OC1h,另外仪器显示温度37℃,但实际只有23℃,自然结果难以令人满意。

7)、SABC染色(37℃):这是博士德的人性化之处,直接就可以用。

8)、DAB显色镜下控时:DAB浓度应该比推荐的要低一些,这样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注意,使用后残余的DAB应妥善处理,而不是随便倒入下水道,因为它有致

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