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关于分子生物学实验基因多态性多态性是指在一个生物群体中,同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型(genotype)或等位基因(allele),亦称遗传多态性(geneticpolymorphism)或基因多态性。DNA片段长度多态性基因多态性DNA重复序列多态性单核苷酸多态性第2页,共18页,2024年2月25日,星期天DNA片段长度多态性(FLP):即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化,而导致DNA片段长度的变化,又称限制性片段长度多态性。DNA重复序列的多态性(RSP):主要表现于重复序列拷贝数的变异,如小卫星DNA和微卫星DNA。单核苷酸多态性(SNP):即散在的单个碱基的不同,基因组中单核苷酸的缺失,插入与重复序列不属於SNP,但更多的是单个碱基的置换。第3页,共18页,2024年2月25日,星期天CLEC是Ctypelectin(C型凝集素)家族基因CLEC4M基因是19号染色体上C型凝集素家族中的一员,它被证明是多种传染性疾病病毒的受体,如HIV-1,SARS-Cov,HCV等。该基因的第4外显子的VNTR(VariableNumberofTandemRepeats,VNTR)在全球人类群体中存在3-9次重复的多态现象,并被认为这种不同长度的多态可能和宿主对病毒的易感性有关。第4页,共18页,2024年2月25日,星期天第5页,共18页,2024年2月25日,星期天CLEC4M与SARS体内存在一种SARS冠状病毒的受体L-SIGN,由CLEC4M基因所编码。该基因第4外显子存在3-9个69bp的重复片段,人群中超过50%的人以7个重复为主,常见的基因型为7/7,5/5,7/5等不同的纯合或杂合状态,这个重复区编码位于胞外受体的颈部。研究表明,纯合型如7/7或5/5的个体较杂合型7/5的个体较少感染SARS病毒。第6页,共18页,2024年2月25日,星期天CLEC4M基因序列第7页,共18页,2024年2月25日,星期天实验原理原理:用裂解液和蛋白酶K裂解口腔黏膜细胞,释放DNA,用浓盐法沉淀蛋白质,离心去除蛋白质,再用异丙醇沉淀DNA。裂解液配方:10mMTris-HCl,10mMKCl,10mMMgCl2,2mMEDTA,0.4MNaCl,1%SDS.第8页,共18页,2024年2月25日,星期天第9页,共18页,2024年2月25日,星期天2×PCRmixddH2O引物1,引物22×PCRmix10μl引物1,引物2各0.4μlddH2O6.2μlDNA样品3μlPCR反应体系,总共20μl第10页,共18页,2024年2月25日,星期天在PCR管盖上标记号码,便于辨认第11页,共18页,2024年2月25日,星期天放入PCR仪,并设置程序变性95℃5min95℃20s30循环59℃30s72℃45s延伸72℃5min第12页,共18页,2024年2月25日,星期天PCR过程大概100分钟第13页,共18页,2024年2月25日,星期天PCR仪器界面和参数第14页,共18页,2024年2月25日,星期天紫外透射分析第15页,共18页,2024年2月25日,星期天点样将PCR扩增产物加入琼脂糖凝胶孔内,点样量10μl第16页,共18页,2024年2月25日,星期天100bpDNAmarker,最亮的为500bp500bp杂合子,根据位置判断为589和727bp。杂带,分子量小,或是引物二聚体结果分析同学们,你们的基因是纯合还是杂合呢?第17页,共18页,2024年2月25日,星期天*感谢大家观看第18页,共18页,2024年2月25日,星期天
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