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植物种质资源离体保存

要点学习目标：掌握离体保存的方法。掌握人工种子的概念及研制的意义。离体保存人工种子

一、离体保存

一、离体保存1、应用保存种质的方法（1）低温干燥法即减少植物种子含水量，同时利用低温干燥环境，来延长种子寿命的方法。该方法是目前保存种质最通用的方法。（2）减压贮藏法降低氧压，以抑制种子呼吸来延长种子寿命。由于对贮藏设备要求太高，该方法尚未普遍推广。（3）冷处理保存法人们受到医学上保存皮肤和精子的启迪，试图利用冷处理(4℃左右)的方法，以降低植物细胞的代谢水平，来探索保存无病毒茎尖分生组织和愈伤组织。此法不仅收效不大，反而出现不少问题。

低温干燥、减压及冷处理三种保存方法，很难进一步延长种质寿命，对种质保存收效不大。近年来开辟了一条极有前途的种质保存方法，即“超低温冷冻保存法”。超低温冷冻保存是指在-80℃以下的超低温环境中保存种质资源，常以液氮为冷源，因此又称液氮保存。由于在超低温条件下，细胞培养物的遗传稳定性得以保存。将超低温冷冻保存技术和组织培养技术结合起来，可望成为保存植物种质的最佳办法。一、离体保存

2、超低温冷冻保存种质的原理（1）常用的这类冷冻防护剂，属于低分子量的中性物质。在水溶液中能强烈地结合水分子。水合作用的结果使溶液的黏度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。因而对于降低培养基冰点和植物组织、细胞的冰点起重要作用。（2）冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。（3）二甲基亚砜除上述作用外，极易渗入细胞内部，可防止细胞在冷冻和融冰时，引起过度脱水而遭受破坏，二甲基亚枫起到保护细胞的作用。一、离体保存

3、超低温冷冻保存种质的技术方法植物材料的特性和材料的预培养对超低温保存植物组织培养物的成活关系很大。同时，冰冻保护剂和使用、降温及解冻方法是植物组织培养物保存的几个关键因素。目前，此问题的研究主要在以下几方面进行。材料特性预培养冰冻保护剂降温冰冻方法解冻方法和解冻后处理一、离体保存

(1).材料特性由于植物基因型、抗冻性及器官、组织和细胞年龄、生理状态等的不同，不同材料冷冻后细胞存活力差别很大。冷冻后存活率的巨大差别不仅表现在种间，而且同种的不同品种间也不同。(2).预培养预培养是改善材料生理状态的有效方法，离体培养物在冷冻前进行预培养能增强细胞的抗寒力。预培养的目的是提高分裂细胞的比例，减少细胞内自由水含量，增强细胞的抗冻力。一、离体保存

(3).冰冻保护剂冰冻保护剂能减少超低温保存造成的伤害。除一些对脱水极不敏感的材料以外，几乎所有的植物材料都需经过冰冻保护剂的处理。保护剂的作用机制是增大膜对水分的通透性，促进细胞外冰冻造成的脱水效果，降低细胞内水分冰点温度，保护蛋白质和酶类。常用的冰冻保护剂大体分两类：一类是能穿透细胞的低分子量化合物（DMSO）以及各种糖类等；另一类是不能穿透细胞的高分子量化合物（如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯二醇等）。在各种保护剂中，DMSO是广泛采用的一种。一、离体保存

(4).降温冰冻方法①快冻法（rapidfreezingmethod）：快冻法是将材料从0℃或其他预处理温度中直接投入液氮中。这样可使细胞内的水还未来得及形成冰晶中心就降到-196℃的安全温度，从而可避免细胞内结冰的危险，使细胞内呈“玻璃化”状态。②逐级冰冻法（stepwisemethod）：培养物预冷却到-20、-50、-70、-100℃停留一段时间后浸入液氮中。一、离体保存

③慢冻与逐级冰冻法结合：将慢冻法与逐级冰冻法结合使用能得到较好的冰冻保存效果。马锋旺和李嘉瑞在保存杏愈伤组织时，开始以1℃/min速度降温至-40℃，停留2h后投入液氮中保存，可获得80.5%的存活率。④干冻法（dryfreezingmethod）：采用无菌空气流、干燥硅胶或饱和溶液表面的气相等对材料进行脱水处理后快速将材料投入液氮贮存，或用冰冻保护剂处理后析出材料表面水分，再以金箔密封进行慢冻后置于液氮中保存。一、离体保存

(5).解冻方法和解冻后处理大量的试验表明，快速化冻法对大多数植物材料都适合，通常的做法是：将冻存后的材料放在25-40℃的水浴中解冻，一旦冰完全熔化后，立即取出材料以防热伤害和高温下保护剂的毒害；此种经脱水处理后的材料宜在室温下缓慢解冻。除了干冻处理的生物材料外，解冻后的材料一般都需洗涤，以除去细胞内高浓度的冰冻保护剂，这对