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细胞筛选

一嘌呤霉素

(一) 确定最优筛选浓度

当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。

培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）

取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。

向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。）

第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。）

每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。

在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一

般生存时间而定，大概需3到14天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞

死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。

(二) 转染细胞

第一天：在 60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。

第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene）

(三) 筛选细胞

病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。

如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。

以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。

待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm平皿内。

60mm平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因敲低效率。

10cm培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存4-5支细胞，待基因敲低鉴定清楚后，解冻冻存细胞，进行表型观察分析。通常情况下，由于慢病毒为复制缺陷型病毒，受感染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，可以移至普通细胞培养室内培养研究。

二G418

(一) 确定最优筛选浓度

由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

G418的配制：取1gG418溶于1ml1mol/L的HEPES液，加蒸馏水定容至10ml（使G418终浓度为0.1g/ml,HEPES终浓度为100mmol/L），过滤消毒，4度保存。

HEPES的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’

-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid），分子量238.31，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间的控制溶液的pH处于恒定的范围，而对细胞无毒性作用。

1mol/LHEPES的简单配置：HEPES23．83g，溶解于80ml的双蒸水中，用

10mol/L的NaOH调节pH至7.2-7.4，定容至100ml，0.22um小滤器过滤。HEPES使用终浓度为10-50mmol/L。

制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内按0ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、

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