(1.5)--糖蛋白分析 生物化学实验.ppt

糖蛋白分析;CONTENTS;1;;1.1凝集素亲和富集法

凝集素是一类含有碳水化合物识别域的蛋白质，可以选择性地识别和结合糖链，已经普遍用于复杂样品中糖蛋白或糖肽的富集。伴刀豆球蛋白(ConA)和麦胚凝集素(WGA)是两种常用的富集糖蛋白的凝集素，ConA主要识别a一甘露糖和a-葡萄糖，ConA优先与高甘露糖型、杂合型和二天线型N-糖链结合，不结合三天线型和四天线型的N-糖链和O-糖链，当N-乙酞葡萄糖胺发生岩藻糖基化则会阻碍结合。WGA可以高特异性识别并结合N-乙酞葡萄糖胺和唾液酸，蓖麻凝集素(RCA120)对半乳糖有高度的亲和力。可以利用凝集素对糖链的高特异性来使用单凝集素亲和法对特定的糖蛋白进行富集，使用多凝集素亲和法可以更全面地对糖蛋白进行富集。各种材料及方法如凝集素微阵、凝集素磁珠、凝集素亲和层析和基于超滤辅助的样p制备(Filteraidedsamplepreparation,FASP)均已被报道用于糖肽富集。

1.2亲水性相互作用富集法

以亲水性相互作用为基础的富集法可广泛用于各种糖肽的富集，最常见的亲水相互作用色谱(Hydrophilicinteractionchromatography,HILIC)是一种新型的用于分离极性化合物的高效液相色谱，也常用于糖肽的分离和富集，该方法简单并且与质谱分析具有良好的兼容性。近年来，各种亲水材料如金属有机骨架(MOFs)、聚合物和磁性材料等均被报道用于糖肽富集。

;1.3肼化学富集法

肼化学富集法是利用糖链中的顺二羟基与载体共价结合从而实现富集，与凝集素相比肼化学富集方法特异性较低。糖肽和载体之间的共价键是不可逆的，因此使用该方法富集时糖链结构被破坏，不能对糖链或完整糖肽进行结构分析。用肼修饰的功能化磁性纳米复合材料也可以对糖肽进行高特异性富集。

1.4硼酸富集法

硼酸可通过在非水溶液或碱性水溶液中与含有1,2或1,3一二醇基团的糖形成共价键的方式，对糖蛋白进行广泛富集。目前己有各种硼酸功能性材料用于糖肽富集，如琼脂糖、介孔材料、功能化磁珠和纳米颗粒，磁珠易于清洗并且可借助外部磁场进行分离，利于自动化分析并减少样品处理时间。硼酸功能化磁珠分离糖蛋白的效果较好，但特异性略弱于基于凝集素的功能化磁珠。将硼酸层析和凝集素亲和层析相结合及硼酸修饰的凝集素也可用于糖肽富集。

;2.糖蛋白定量方法

即使相同的蛋白，不同的电荷状态、肽段长度、氨基酸组成或翻译后修饰会导致肽的离子强度差异很大。因此，为了使离子强度能用于准确定量，不同样品间只能基于相同条件下同一肽段进行比较。基于质谱的蛋白定量方法可以分为稳定同位素标记法、非标记定量法和通过加入稳定同位素标记的标准肽进行的绝对定量(Absolutequantification,AQUA)。AQUA方法对目标肽段具有很高的特异性，不存在色谱行为差异，灵敏度高，用单反应监测定量线性范围可扩展到5个数量级，但是由于样品制备过程中样品会出现损失，并不能反映该蛋白在生物样品中表达的真实水平。研究表明，稳定同位素标记法定量的相对标准偏差一般低于10%，基于质谱的峰值强度或提取离子流色谱图定量的准确度通常在30%以内。相比之下，基于图谱总数的非标定量的精度可低至50%。

2.1非标定量法

非标定量法(Label-free)可以根据质谱中相同肽段的质谱信号强度对肽段以及对应的蛋白进行相对定量。其定量可以基于峰强度或图谱计数进行。图谱计数法是将每个蛋白鉴定到的总图谱数作为定量依据，原理是在碎片离子扫描中，高丰度的肽或蛋白质更容易采集到更多的图谱，可用于样品内或样品间的相对定量。该方法速度快、操作简单，但是对于低丰度和图谱数少的蛋白来说准确度更差。基于质谱峰强度的定量法则是根据一级质谱中的峰强度进行相对定量。由于不同肽段的电离效率不同，不同样品之间只能对相同离子进行比较，此外二级中会出现母离子峰覆盖不连续问题。非标定量法操作方便、费用低并且无样品数目限制，然而需要仪器稳定性和重复性好。

;2.2代谢标记法

通过稳定同位素标记的氨基酸培养细胞进行标记(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture,SILAC)用碳十三和氮十五标记的赖氨酸和精氨酸对糖蛋白进行定量已被报道。SILAC法直接、高效、定量精确，但标记后不能进行生物反应，不利于糖蛋白富集。通过叠氮或炔基对天然单糖进行化学修饰的非天然糖代谢标记技术可以对糖链进行代谢标记“i1。最近研究表明非天然糖代谢标记存在半肤氨酸进行无酶催化的糖基化修饰的负反应，除去乙酞基保护后的Ga1NAz则可以避免。

2.3180标记法

180标记是一种简单、方便、稳定的同位素标记方法，只需要H2.180