自然保护区陆生脊椎动物蚂蝗iDNA监测技术规程--标准草案.docx

自然保护区陆生脊椎动物蚂蝗iDNA监测技术规程

1范围

本文件以蚂蝗为代表性样本，规定了基于iDNA（无脊椎动物来源的DNA）对自然保护区的陆生脊椎动物进行物种多样性调查的监测样点布设、监测时间及频次的设置、样本的采集和保存、DNA提取纯化、DNA宏条形码扩增、高通量测序数据的存储和分析、质量控制和质量保证。

本文件适用于林业系统的管理机构和进行相关研究的学术机构在可采集到吸血性蚂蝗的自然保护区开展陆生脊椎动物的调查和监测工作。其他地区陆生脊椎动物的调查、监测可参照使用。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB/T15628.1-2021国家脊椎动物物种名称代码标准

GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T30989-2014高通量基因测序技术指南

GB/T42398-2023细胞培养洁净室设计技术规范SN/T4714-2016DNA条形码数据库技术规范

SN/T4835-2017实验室生物废弃物管理要求HJ710生物多样性观测技术导则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

无脊椎动物来源的DNAinvertebrate-derivedDNA

一种特殊的环境DNA，通过采集无脊椎动物——包括血吸性寄生虫（如蚂蝗、蚊子等）和以腐尸、粪便为食的动物（如苍蝇等）——来获得的脊椎动物DNA。

3.2

陆生脊椎动物terrestrialvertebrates

根据现有的动物分类标准，包括哺乳纲、鸟纲、两栖纲、爬行纲这四个主要类群的动物。

3.3

样地sampleplot

在调查区域内按照一定要求设定的一定范围的调查地段或地块，样地的形式可以是样线、样方或样点。

3.4

引物primer

人工合成的DNA序列，其功能是作为DNA复制的起始点，被广泛应用于聚合酶链式反应、测序和探针合成等。

3.5

聚合酶链式反应polymerasechainreaction

以一对引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在耐热DNA聚合酶、合适的缓冲液体系和温度条件下，对极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段进行选择性体外扩增的方法。

3.6

高通量测序high-throughputsequencing

不同于传统Sanger（双脱氧法）测序，能一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术，通常一次测序反应能产出不低于100Mb的数据。

3.7

测序序列reads

高通量测序平台产生的碱基序列称为reads。

3.8

DNA条形码DNAbarcoding

生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。

3.9

DNA宏条形码DNAmetabarcoding

DNA条形码（DNAbarcoding）与高通量测序的结合，以混合样本（如环境DNA、群落DNA）为模板，对条形码基因的一段序列（通常为100~200bp）进行扩增和测序，然后对测序数据进行生物信息学分析，从而获得样本中物种组成的信息。

3.10

DNA文库DNAlibrary

由大量两端接上了特定DNA接头的DNA片段所组成的DNA混合物。

3.11

接头adaptor

一种特定的寡核苷酸序列，与测序芯片上的引物互补，通过互补杂交将DNA文库中的DNA片段固定在芯片上。

3.12

标签tag

一段寡核苷酸的短序列，通常在合成引物时添加在上游和下游引物的5‘端，用于标记不同的PCR产物，允许多个样本可以混合在同一个DNA文库中，通过这些标签可以将测序数据分配到对应的样本。

3.13

核糖体RNAribosomalRNA

核糖体RNA是核糖体的主要成分之一，而核糖体是细胞中的一种细胞器，由一大一小两个亚基结合而成，在细胞中是RNA翻译成蛋白质的主要场所。

3.14

12S核糖体RNA12SribosomalRNA

后生动物线粒体基因之一，负责编码的是核糖体RNA小亚基基因序列。

3.15

16S核糖体RNA16SribosomalRNA

后生动物线粒体基因之一，负责编码的是核糖体RNA大亚基基因序列。

3.16

阴性对照negativecontrol

确定不含任何物种DNA的样本（如无菌水），与正式样本同步操作，作为判断实验是否被污染和过滤数据的参照。

3.17

阳性对照positivecontrol

已知物种或已知DNA序列组成的样本