质粒电泳和连接产物的转化.pptVIP

连接产物的转化1、puc19质粒用HindIII和EcoRI酶切，线性化；2、目的片段用HindIII和EcoRI酶切，线性化；3、回收酶切后的质粒和目的片段，定量,连接；一实验目的掌握细菌转化的一般技术和原理。二实验原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。使受体细菌从周围介质中吸收外来DNA分子，从而获得新的遗传物质的过程就是转化。通常所用的受体是大肠杆菌。用于转化的细菌被称为感受态细胞。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5x106~2x107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆实验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。大肠杆菌的转化常用热激法，该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。除热击法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。DNA分子转化分以下几步:1.吸附－－双链DNA分子吸附于受体菌表面；2.转入－－双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；3.自稳－－外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；4.表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译实验步骤：1）将2μl连接产物与100μl感受态细胞在冰上混匀，并静置30min，42℃下处理60sec，然后加入600μl的LB（A-）液体培养基，在摇床上37℃摇动培养1hr。（2）(在LB（A+）平板上涂布40μl的X-gal和4μlIPTG溶液)待完全吸收后，将转化产物离心后悬浮，涂平板。37℃过夜培养。