流式细胞相关操作.docx

1型糖尿病药物疗效的流式细胞仪操作

原理：体内各T淋巴细胞亚群相互作用维持着机体的正常免疫功能,在保护机体免受各种病原体感染的过程中起着重要的作用。CD3、CD4、CD8均为随T细胞分化过程出现的抗原故又称T细胞分化抗原。CD3抗原分布于所有成熟的T细胞膜上,是所有的T细胞都具有的分化抗原,也是鉴定外周血中T细胞的最好标志。CD4和CD8亚群是一对相互排斥的分化抗原,正常人CD4+T细胞约占T细胞总数的65%,可分为Thl和Th2两个亚群。CD4+多为辅助性T细胞(Th),通常是识别抗原递呈细胞外表与MHCⅡ类分子结合的抗原,具有辅助体液免疫和细胞免疫的功能。Thl、Th2细胞依赖它们产生的细胞因子还有相互调节和制约作用。CD8分子多由抑制性T细胞(Ts)和细胞毒性T细胞(CTL)表达,是鉴定此两种细胞亚群的主要标志。Ts细胞在免疫应答中主要起抑制性调节作用,通过抑制Th细胞的活性,抑制抗体形成和细胞介导免疫应答的作用。CTL细胞具有细胞毒活性可以杀伤带有抗原的靶细胞。CD4/CD8正常机体为1.5以上。一般认为CD4+T细胞减少,CD4/CD8下降,意味着机体免疫功能低下。。

本实验主要观察小鼠脾脏中的Th1、Th2、Treg、Th17细胞。主要选取的抗体有：CD3，CD4，CD8，Foxp3＋，RoRγt＋，T-bet＋等。

流式细胞分析T细胞亚型

处死各组小鼠，每组3只，取脾脏，遵照相关流式操作流程处理脾细胞。，封闭液来自正常小鼠或大鼠血清〔表2.2〕，每组检测8个不同的指标，分别设为空白对照管、CD4＋管、CD4＋CD25＋管、Foxp3＋单标管、Foxp3＋/CD4＋CD25＋管、RoRγt＋/CD4＋管、T-bet＋/CD4＋管和GATA-3＋/CD4＋管〔表2.3〕[6]。

Table2.1Propertiesofantibodiesusedinflowcytometricanalysis.

Host

Isotype

Reactivity

Conjugate

Cat.No.

Anti-CD4

Rat

IgG2b,kappa

Mouse

APC-eFluor780

47-0041-80

Anti-CD25

Rat

IgG1,lambda

Mouse

PE

12-0251-81

Anti-Foxp3

Rat

IgG2a,kappa

Mouse

AlexaFluor488

53-5773-80

Anti-RoRγt

Rat

IgG1,kappa

Mouse

PE

12-6981-80

Anti-T-bet

Mouse

IgG1,kappa

Mouse

PE

12-5825-80

Anti-GATA-3

Rat

IgG2b,kappa

Human,Mouse

PerCP-eFluor710

46-9966-41

AllsixantibodieswerepurchasedfromeBioscience.

Table2.2SerumandantibodiesusedforstainingcorrespondingTcellssubsets.

BlockingforFCR

Cell-surfaceantibody

Blockingfornuclearreceptor

Nuclearantibody

Tregs

Ratserum

CD4，CD25

Ratserum

Foxp3

Th17

Ratserum

CD4

Ratserum

RoRγt

Th1

Ratserum

CD4

Mouseserum

T-bet

Th2

Ratserum

CD4

Ratserum

GATA-3

Table2.3Subjectsandantibodiesintheminvestigatedinthisstudy.

设定管/组

需加抗体

空白对照管

—

CD4＋管

+CD4

CD4＋CD25＋管

+CD4、CD25

Foxp3＋单标管

+Foxp3

Foxp3＋/CD4＋CD25＋管

+Foxp3、CD4、CD25

RoRγt＋/CD4＋管

+CD4、RoRγt

T-bet＋/CD4＋管

+CD4、T-bet

GATA-3＋/CD4＋管

+CD4、GATA-3

详细步骤如下：

1、获取脾脏，参加5-10mLeBioscience?流式染色缓冲液(eBioscienceCat.No.00-4222)，使用3mL注射器注射心研磨组织。?

2、收集经研磨获得的细胞悬液，共10mL，过滤〔消除细胞团块和碎片〕至离心管中。

3、裂解小鼠脾脏红细胞，通常一个脾脏使用5mL裂解液，裂解5分钟左右，最长不超15min。裂解至溶液透