酶活方法分析和总结.docxVIP

对于分批发酵，在其对数生长期取样，而对于连续发酵，在培养达到稳态持续4个停留时间以后取样。在4℃、10000rpm下离心15min收获菌体，用粗酶制备缓冲液洗2次，然后悬浮于同样的缓冲液中，用超声波破碎仪破碎细胞，间隔30s共计5min。离心除去细胞碎片，得到的上清液即为粗酶液，可即刻或暂保存于-20℃冰箱，用于酶活的测量。所有的实验操作均在冰浴中进行。

酶活的测量在控温30℃的分光光度计中进行。所有的反应混合物加入到光程为1cm的石英比色皿中，通过最后加入细胞抽提液或者底物引发反应，反应终体积为1ml。NAD+、NADH、NADP+和NADPH的检测波长为340nm，毫摩尔消光系数为6.22cm-1mM-1;乙酰辅酶A的检测波长为412nm，毫摩尔消光系数为13.6cm-1mM-1;延胡索酸的检测波长为24Onm，毫摩尔消光系数为1.62cm-1mM-1。定义每单位酶活为每分钟每毫克蛋白质转化1μmol底物为特定产物所需的酶量。

酶活的具体测量方法如下:1、己糖激酶（Glk）

己糖激酶

己糖激酶

葡萄糖+ATP

葡萄糖+ATP————————葡糖-6-磷酸+ADP

葡糖-6-磷酸脱氢酶

葡糖-6-磷酸脱氢酶

葡糖-6-磷酸+NADP+

葡糖-6-磷酸+NADP+————————————葡糖酸-6-磷酸+NADPH

监测340nm处NADP的减少，反应物包括：0.1MTris-HCl缓冲液

监测340nm处NADP的减少，反应物包括：0.1MTris-HCl缓冲液

(PH7.5)，60mMMgCl,1mMDTT,0.5mMNADP,2mMATP,15mM

2

葡萄糖,

细胞提取物，2U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

2、磷酸葡萄糖异构酶(Pgi):0.1MTris-HCI(PH7.8)，10mMMgCl2，

0.5mMNADP+，1U6-磷酸葡萄糖脱氢酶，2mMF-6-P(F6P)。

3、磷酸果糖激酶(Pfk):50mMimidazol-HCl(pH7.0)，0.05mMATP，

5mMMgC12，1mMEDTA，0.25mMNADH，0.25mMF6P，0.5U醛缩酶，

0.5U3-磷酸甘油醛脱氢酶，0.5U磷酸丙糖异构酶。

4、1,6-二磷酸果糖醛缩酶(Fba，EC4.1.2.13):0.05MTris-HCl(pH7.5)，0.1mMCysteine-hydrochloride,0.1MKAc,2mMFDP,0.7mMCoCl2，0.25mMNADH，20U磷酸丙糖同分异构酶，2U3-磷酸甘油醛脱氢酶。

5、磷酸丙糖异构酶

以DHAP为底物,生成的果糖-6-磷酸以酶偶联方法检测。1ml测活反应体系中含有:100mmol/LTris·HCl,pH8.8,10mmol/LMgCl2,0.5mmol/LEDTA,0.1g/LBSA,0.3mmol/LNADP+,

0.6uG-6-PDH, 1.24uPGI,1.4mmol/LDHAP,加入待测酶溶液引发反应,25℃反应几分钟后记录A340的变化。

6、甘油酸-3-磷酸脱氢酶(EC1.2.1.12):3-磷酸甘油酸,2mM;三

磷酸腺苷(potassium salt), 2 mM;MgCl2, 5 mM;NADPHorNADH,0.5mM;磷酸甘油酸激酶,1.5U;and细胞提取物,20Al(0.4mgofprotein)(gasphase,N,)。

7、磷酸甘油酸激酶

8、磷酸甘油酸变位酶

9、烯醇化酶

10、丙酮酸激酶(pyk，EC2.7.1.40):0.1MTris-HCl(pH7.5)，5mMADP，1mMDTT，10mMKCl，15mMMgC12，0.5mMPEP，0.25mMNADH，

10U乳酸脱氢酶。

11、丙酮酸脱氢酶复合酶

柠檬酸合酶(Cs):0.1MTris-HCI(pH8.0)，8mM乙酰-CoA，l0mM草酰乙酸钠,10mM DTNB。

12、顺乌头酸酶

13、异柠檬酸脱氢酶(ICDH):0.1MTris-HCl(PH7.4)，1mMEDTA，0.3mMDithiothreitolacid，0.2ml20mMMnS04，0.2ml10mMNADP+，0.05ml80mMisocitrate。

14、α-酮戊二酸脱氢酶100mMTri-K+缓冲液（PH8.6），10 mM丙酮酸钠或α-酮戊