12.生物技术在植物育种中的应用.ppt

这样可使PCR产物高效地克隆到载体上。将连接产物转化大肠杆菌，涂平板，挑选重组克隆，测序分析、设计引物、PCR扩增，检测是否还能扩增出原来的多态性条带。这种转化成功的标记就称为SCAR标记。由于SCAR标记所用的引物长，特异性扩增重复性好，可有效地用于分子育种。第62页，共103页。3、扩增片段长度多态性标记（AFLP）

它是荷兰Keygene公司科学家Marc和Pieter1993年创造发明的一种DNA分子标记。该技术是对限制性核酸内切酶片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100-150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性的研究。第63页，共103页。⑴原理首先对基因组DNA进行双酶切，其中一种为酶切频率较高的限制性内切酶，另一种为酶切频率较低的内切酶。用酶切频率较高的限制性内切酶消化基因组DNA是为了产生易与扩增的、而且可在任何测序胶上能较好分离出大小合适的短DNA片段；用后者消化基因组DNA是限制用于扩增的模板DNA片段的数量。AFLP扩增数量是由酶切频率较低的限制性内切酶在基因组中的酶切位点数量决定的。第64页，共103页。将酶切片段和含有与其粘性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反应的引物结合位点，通过选择在末端上分别添加1-3个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异扩增，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。第65页，共103页。为了避免AFLP分析中的同位素操作，目前已发展了AFLP荧光标记、银染等新的检测扩增产物的手段。⑵特点AFLP技术结合了RFLP稳定性和PCR技术高效性的优点，不需要预先知道DNA序列的信息，因而可以用于任何动植物的基因组研究。第66页，共103页。AFLP多态性远远超过其它分子标记，利用放射性同位素在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳可检测到50-100条AFLP扩增产物，一次PCR反应可以同时检测多个遗传位点，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。AFLP标记具有共显性表达、无复等位效应等优点，表现孟德尔方式遗传。

该技术受专利保护，目前用于分析的试剂盒价格较贵，分析成本高，对DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高，这是它的不足之处。第67页，共103页。4、SSR

1987年Nakamura发现生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列，它们在生物体内多态性水平极高，一般称为可变数目串联重复序列，简称VNTR（variablenumbertandemrepeat）。VNTR标记包括小卫星（minisatellites）和微卫星（microsatellites）标记两种。第68页，共103页。微卫星标记即SSR标记，是一类由1-6个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置。对SSR的研究最早始于动物基因组，特别是人类和哺乳动物基因组的研究。目前植物SSR研究也非常活跃。第69页，共103页。⑴原理尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。第70页，共103页。一般地，同一类微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，通过其重复次数的不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位的多态性。SSR标记多态性丰富，重复性好，其标记呈共显性，分散分布于基因组中。第71页，共103页。建立SSR标记必须克隆足够数量的SSR并进行测序，设计相应的PCR引物。其一般程序如下：①建立基因组DNA的质粒文库；

②根据欲得到的SSR类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆第72页，共103页。③对阳性克隆DNA插入序列测序；

④根据SSR两侧序列设计并合成引物；

⑤以待研究的植物DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增反应第73页，共103页。三、分子标记辅助选择育种传统的育种主要是根据植株的表现型进行选择，而环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素都会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择鉴定工作更困难，如何提高选择效率，是育种工作的关键。第30页，共103页。育种者在长期的实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花