《灵芝及灵芝提取物中β-葡聚糖的测定》.docx

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灵芝及灵芝提取物中β-葡聚糖的测定

1范围

本文件规定了灵芝及灵芝提取物相关产品中β-葡聚糖的分光光度法检测方法。本文件适用于灵芝实体，灵芝孢子粉和灵芝提取物中β-葡聚糖的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1β-葡聚糖β-glucan

以β-葡聚糖为主链，可溶于水的一系列高分子化合物。

4原理

灵芝子实体，灵芝孢子粉和灵芝提取物中β-葡聚糖和α-葡聚糖经水提取，使用α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶（糖化淀粉酶）酶解α-葡聚糖成单糖和寡糖；使用纤维素酶酶解纤维素成单糖和寡糖；使用蛋白质酶酶解蛋白质成氨基酸；乙醇沉淀β-葡聚糖，单糖、寡糖和氨基酸溶于乙醇被除去；β-葡聚糖经水溶解，在硫酸的作用下，先水解成单糖，并迅速脱水形成糖醛化合物，与苯酚形成黄色化合物，在485nm下具有特征吸收，与标准系列比较定量。

5试剂和材料

除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水。

5.1试剂

5.1.1硫酸（H2SO4），ρ=1.84g/mL。

5.1.2无水乙醇（C2H5OH）。

5.1.3苯酚（C6H5OH）。

5.1.4盐酸（HCI）。

5.1.5β-葡聚糖对照品。

5.1.6α-淀粉酶（CAS:9000-85-5，20000-60000U/mL）。

5.1.7纤维素酶（CAS:9012-54-8，≥45U/mg）。

5.1.8蛋白酶（CAS:9014-01-1，≥200U/mg）。

5.1.9淀粉葡萄糖苷酶（CAS:9032-08-0，≥10万U/mL）。

5.1.10盐酸溶液（0.2mol/L）：取18.00mL盐酸在搅拌状态下缓慢加入到800mL水中，混匀，冷却后用水稀释至1000mL，即得。

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5.1.11氢氧化钠溶液（0.2mol/L）：取8.00g氢氧化钠在搅拌状态下缓慢加入到800mL水中，混匀，冷却后用水稀释至1000mL，即得。

5.1.12β-葡聚糖对照品溶液制备：精密称取β-葡聚糖对照品10mg，加水溶解并定容至100ml，混匀，即得0.1mg/mL的β-葡聚糖对照品溶液。

5.1.13苯酚溶液（50g/L）：称取苯酚5.0g，加水溶解并定容至100ml，混匀，即得。

6仪器与设备

6.1紫外分光光度计。

6.2分析天平：感量为0.0001g和0.01g。

6.3电热恒温水浴锅。

6.4冰箱。

6.5离心机：转速不低于4000r/min。

6.6漩涡混合振荡器。

7分析步骤

7.1样品前处理

取样品约0.5g放入锥形瓶或50mL离心管中，加入10mL水，将样品涡旋至完全溶解，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节溶液至pH6.9，加入0.1mL淀粉酶，并在20℃恒温水浴振荡2小时酶解。用0.2mol/L盐酸溶液将溶液的pH值调至5.0加入10mg纤维素酶，并在37℃恒温水浴酶解2小时。用0.2mol/L氢氧化钠将溶液的pH值调至7.5，向溶液中加入约50mg的蛋白酶，并在37℃恒温水浴振荡2小时酶解。用0.2mol/L盐酸溶液调节pH至4.8，将约0.1mL的淀粉葡萄糖苷酶添加到溶液，并在60℃恒温水浴中振摇2小时酶解。酶解液转移并用水洗涤干净至50mL容量瓶，用水定容至刻度。将溶液转移至50mL离心管，将溶液离心（3000rpm，10min），取上清液5mL于50mL离心管，加入20mL无水乙醇，摇匀（多管式涡旋振荡器，转速：约2000rpm，10min），放置4℃沉淀过夜（8h以上）。将溶液离心（3000rpm，20min），弃上清液。向沉淀中加入25mL80%乙醇样品，并在4℃下沉淀1小时。将溶液离心（3000rpm，20min）。离心后弃去上清液，沉淀加水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

7.2标准工作曲线的绘制

精密量取β-葡聚糖对照品溶液0mL、0.2mL、0.4mL