细胞处理分析和总结.docxVIP

冰存细胞悬液的制备

按常规方法消化处于对数生长期的A549细胞培养物，制备单细胞悬液，将细胞悬液以2000rpm离心5min，去上清液；

向细胞沉淀物中加入冰冻保护液(9：1血清：10％DMSO)轻轻吹打混匀，使细胞密度达l×106_1×107个／ml；

按每管lml的量分装于冰存管内，拧紧管盖，封口膜封VI；(4)在冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期

细胞复苏

从液氮罐中取出A549细胞后迅速放入37C水浴中，约80％的细胞解冻后拿出水浴；

用移液枪转移细胞悬液至离心管；(3)以2000rpm离心8min：

(4)弃上清，1640完全培养液，吹打、混匀，放入C02培养箱培养。

传代培养

待细胞长满培养瓶，将培养液弃去；

PBS清洗培养瓶，弃液后加入1ml胰酶(含EDTA)；

轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，放入C02培养箱静置2min,待细胞层略有松动，肉眼可见到流砂状时，加1640完全培养液终止消化，轻轻吹打瓶壁，吸取细胞至离心管中.

以2000rpm离心5min：

加入2ml640完全培养液，用移液枪将细胞沉淀吹打成悬液，加入两个培养瓶，各加入1640培养液7ml，置于37℃下继续培养。第二天观察

细胞生长情况。

收集细胞

种植8个培养皿的细胞，用含有5000ug／ml茶氨酸浓度的l640完全培养液处理A549细胞各0h,15min,30min,1h,2h,6h,12h,24h, PBS缓冲液漂洗细胞2次；

蛋白样品制备

1、倒掉培养液，向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min

2、用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中（注意冰上操作）

3、于4℃下12000rpm离心5min。

4、将离心后的上清分装转移倒1.5ml的离心管中放于-80℃保存。

蛋白含量的测定

取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml

的蛋白标准溶

液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。

取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl25mg/ml蛋白标准，加入980μl稀

释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简

便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。

根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5ml

BCA试剂A加100μlBCA试剂B，混匀，配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。

将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl 加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到

20μl。

加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。

各孔加入200μlBCA工作液,37℃放置20-30分钟。

注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加

深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。

测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度

SDS－PAGE电泳

1、清洗玻璃板，玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。

2、灌胶：配10％下层胶（15ml，两块胶，每块胶在6.5ml左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后用无水乙醇压平，静置45min

3、胶凝后，弃去无水乙醇，用水冲洗2次，并用吸水纸将水吸干。

4、等待胶凝期间可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量

5、配5％的上层胶（6ml，两块胶）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，静置45min

6、将玻璃夹取出，在流水中冲洗，洗去正反面余胶，在水流中拔掉梳子，放入电泳箱。7、上样 Marker 6μl

样本 20-30μl

电泳：加入1XRunningBuffer，通入电源，电压100V，电流300mA，功率50W，时间1.5hour。(电泳15分钟后可调节电压到130V)电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

转膜

1、配制转膜液

2、事先将PDVF膜放在甲醇溶液中激活，同时将4X2层滤纸放入转膜液中，尽量