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CIK细胞制备标准操作程序

崇州医院治疗中心 标准操作程序

崇州医院细胞治疗中心 标准操作程序

CIK细胞制备SOP-TC-001第PAGE6页共12页

CIK细胞制备SOP-TC-001第PAGE3页共12页

（75cm2Flask），CO2透气培养袋，15ml离心管，50ml离心管，5ml移液管，10ml移液管，50ml一次性注射器,5ml一次性注射器，200ul枪头。

记录

DC-CIK细胞制备记录。

职责：

细胞培养技术人员应严格按照本规程的规定进行CIK细胞培养操作。

QA负责监督细胞培养技术人员的操作全过程，确保CIK细胞培养操作的规范性。

审核人负责保证本规程的审核和全过程准确有效。

工作程序：

实验前准备：

洁净区及工作台紫外照射≥30min，风机开启30分钟。

物料准备：将已灭菌且在有效期内器械放于物料传递窗进行紫外照射，≥30min后，去包布，经酒精擦拭后放入生物安全柜中备用。

单核细胞分离液（Ficoll）提前30min从4℃冰箱取出待用。

单核细胞分离液（Ficoll），GT-T551培养基，血清，在实验前需提前准备好放入生物安全柜中，以便其恢复常温，否则将会影响实验效果。

分离

制备血浆：

将样本从医疗器械盒中小心地取出，用酒精擦拭消毒后放入生物安全柜。

打开器械盒（注意手不得从打开的器械盒上方通过），用生物安全柜中的止血钳从器械盒中取出灭菌指示卡，确认已灭菌。取出器械盒中止血钳，用其夹紧血袋软管下方。

用浸泡过碘伏和酒精的棉签对软管中上部交替消毒两次，（先碘伏，后酒精，如此交替两次）用生物安全柜中的止血钳取出器械盒中的医用剪刀，用碘伏和酒精对其交替消毒两次，用医用剪刀将软管剪断。将全血转移至50ml离心管，每管25ml。

室温1800rpm，离心10分钟（离心机升降速以ST16为例:升9降4）。

取上层血浆至50ml离心管，灭活（56℃水浴30min）。

4℃放置30分钟。

2800rpm离心8min,，上清分于3支15ml离心管中，-20℃保存。

提取PBMC：

将生理盐水经酒精擦拭消毒后放入生物安全柜中，用碘伏和酒精对生理盐水瓶瓶口进行2次交替消毒后，用止血钳将瓶塞扒开并放置于工作台右上方位置。

按生理盐水：血细胞=1.5:1对血细胞进行稀释，混匀。

按照1.5：1的比例，加生理盐水至吸弃血浆后的样本，混匀，缓慢加在Ficoll液面上（方法：将离心管倾斜45°，在Ficoll液面上1cm处，缓慢注入稀释的血细胞，不要打乱液面界面），加入后终体积不超过45ml，2000rpm，20min，室温(注意：调整离心机加速和减速过程为最低，调电动移液枪输出速度至最低）。

离心后，小心取出离心管，可清晰看到细胞分层。注意轻拿轻放，保持离心管竖直放置，以免破坏细胞分层。

用巴氏滴管缓慢提取Ficoll层与血浆层交界处的白膜层细胞，按照二个离心管对应一个离心管进行漂洗的原则，将提取的白膜层细胞装入50ml离心管中。补充生理盐水至45ml，混匀，1600rpm，5分钟。

弃上清，用生理盐水重悬，收集于一个50ml离心管中，补充生理盐水至45ml。1200rpm，10min。

弃上清，再次添加生理盐水重悬至45mL，混匀，取0.5ml中层悬液至1.5mlEP管中计数，1000rpm，10min。

取上清至15ml离心管中，标记，送检微生物并留样，上清量应满足检测及留样要求，其余上清废弃。

接种：

用培养基调整细胞浓度为1~2?106/ml。

D0天完全培养基配制：每20ml培养基（10%自体血清）添加1支CIK条件培养基（规格：500ul/支）。

混匀，根据培养液体积添加到25cm2Flask或者75cm2Flask中。

水平放入37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养。

填写相关记录,清场。

加液

时间及方式：当培养基颜色变黄或细胞浓度接近饱和时，以倍增方式补液。

一般加液时间为：D2，D4，D6，D8，D10，D12（加液时间视细胞具体生长情况可提前或延后）。

D2-D14天，完全培养基的配制：每瓶培养基（1000ml）添加1支CIK条件培养基2（规格：1ml/支）

添加方法：轻轻摇匀，避免起气泡；拧好瓶盖，水平放入37℃、5%CO2培养箱继续培养。

转瓶：当75cm2Flask细胞悬液总体积达到60ml，且需要继续补液时。

将75cm2Flask中细胞悬液全部倒入