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使用Stunner对蛋白浓度和粒径进行全面的表征

简介

在生物开发和制造的每个阶段，蛋白质定量和分子大小与分子量的生物物理表征是

了解样品发生了什么的第一步。科学家为此使用的许多工具，而占用了太多时间和

大量宝贵的样品。因此，高通量、低体积的表征方法对于评估蛋白质和加快管线速

度至关重要。

常规蛋白质浓度的分析通常依赖于难以追踪的稀释度、昂贵的染料或复杂的标准曲

线。这些方法引入的偏差可能会影响结果的准确性和精确性。

直径和多分散性是确定蛋白质制剂是否发生聚集，以评估其质量的关键属性。动态

光散射技术（DLS）是通过非侵入性测定这些参数的经典方法，但许多DLS仪器

都是基于比色皿，并且每次只能测量一个样品。此外，这些仪器中的许多都需要大

量稀释才能获得准确、可靠的结果。

Stunner是一款将高通量UV/Vis与旋转角度DLS（RADLS）和多角度静态光散射

（MALS）相结合的平台。其可在仅2µL的样品上读取包括蛋白质浓度、分子量、

颗粒数、尺寸和多分散性（图1）等全面的数据。Stunner的所有RADLS和

UV/Vis数据都是以96孔板为规格的板材进行测量的，每个样品只需不到2分钟，

无需稀释、设立标准或使用染料。

本应用陈述了如何使用Stunner来确定溶液中蛋白质和颗粒的大小和多分散性，量

化蛋白质浓度，测量蛋白质分子量，并检查聚集情况。

要深入了解RADLS的细节，请参阅技术说明“深入了解Stunner的光散射技术”。

图1:Stunner是一款在同一个2µL样品上汇集UV/Vis、RADLS和MALS数据的系统

方法

将10g/L的聚苯乙烯41nm和202nmNISTTM可追溯尺寸标准品（ThermoFisher

Catalog#33040A和3200A）的储备溶液分别在水中稀释10倍和50倍，并在

Stunner中测量20次。通过将41和202nm微球在水中分别稀释至0.24和

0.012g/L的最终浓度，来制备20:1的混合体系样品，然后一式三份进行测量。

将牛血清白蛋白(BSA)、白蛋白、人免疫球蛋白G（IgG）和卵清蛋白

（MilliporeSigma）的冻干粉在磷酸盐缓冲液（PBS）中复溶。将所有这些储备溶

液和牛RNaseA（Qiagen）的溶液一样都在PBS中稀释至5mg/mL。然后通过

0.1或0.02µm注射器过滤器过滤所有工作溶液，并一式四份进行测量。

将单克隆抗体（mAb1）在5mM琥珀酸钠、60mM海藻糖（pH5.0）中稀释至

10mg/mL，并通过0.1µm注射器过滤器过滤。从mAb1溶液中取出等分试样，加

热至~80°C孵育15分钟以诱导聚集。然后将聚集的mAb1与未聚集的样品以99:1

和9:1的比例组合，分别制备99%和90%的mAb1样品。所有样品在Stunner上

一式八份进行测量。将mAb1的另一等分试样在~80°C下加热30分钟，并在0秒、

10秒、30秒、1分钟、3分钟、5分钟、10分钟和30分钟取样。这些时间点的

样品在Stunner上一式四份进行测量。

使用Stunner应用模块中“蛋白质（浊度）+RADLS”评估蛋白质浓度、颗粒浓度、

分子量、瑞利比、流体动力学尺寸和多分散性。NISTTM可追溯尺寸标准品，使用

“浓度+尺寸”应用模块进行测量。在适当的情况下，使用PBS、水或琥珀酸缓冲液

（如上所述）作为空白。在20°C下，水和PBS的缓冲液粘度和折射率分别为

1.002cP和1.334，而琥珀酸缓冲液的值分别为1.105cP和1.336。RADLS使用

7个角度、5次采集和1秒时长的默认采集设置，并使用软件的自动角度选择和异

常值排除功能。表1包含使用的所有蛋白质的E1%值。

表1:所用蛋白的EI%值

结果

测量数据非常接近，重复性很好

纳米颗粒标准品的精确尺寸使任何生物制品分析方法的验证都更简单。Stunner的

RADLS测量多个角度，因此它可以看到难以探测的大颗粒物。此外，RADLS光学

器件可自我优化，自动调整以获得每次测量和采样的最佳光束重叠。这意味着

Stunner的RADLS可以提供非常精确的DLS读数，并且可以很容易地从2µL的样

品中确定溶液中颗粒的大小。

在Stunner上测量了41nm和202nm的聚苯乙烯NISTTM