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检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

invivo：在体内invitro：在体外

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用

①FRET技术（invivo）

FRET，Fluorescenceresonanceenergytransfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：

以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。

②酵母双、三杂交技术（invivo）

酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。

一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：

由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示：

如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。

将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。

酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示：

如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。

③Pulldown技术（invitro）

Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的

③ScreenaPhagecDNA-librarybyDNAprobe（invitro）

该方法又成为原位筛选法，用于检测cDNA文库中的蛋白与DNA探针之间的相互作用。其原理和实验流程如下图所示，首先是用噬菌体（phage）侵染大肠杆菌，然后将这些大肠杆菌涂到平板上。接着进行转膜，将膜泡于IPTG水溶液中数小时，然后将该膜放于平板上，培养数小时（IPTG能诱导大肠杆菌表达文库蛋白）。将膜取出，进行变性、复性和封闭（过夜），然后与放射性标记的DNA探针进行反应，最后洗膜、晾干并用胶片曝光。如果胶片上出现了条带，说明该文库蛋白与DNA探针有相互作用；反之则说明两者无相互作用。

④酵母单杂交系统（invivo）

酵母单杂交系统的原理与双杂交一样，不同的是它主要用于考察cDNA文库中的蛋白与DNA（即特异的已知靶因子）是否有相互作用。其原理如下图所示。首先需要构建一段序列（黑框），它含有至少3个拷贝的特异的已知靶因子以及报告基因的序列。将该序列整合到酵母的基因组中，得到重组酵母。接着构建一个融合表达载体，它含有待考察蛋白的基因序列与转录激活结构域的序列。将该融合表达载体转入酵母中，观察报告基因是否能正常表达。如果报告基因正常表达，说明该cDNA文库蛋白与已知的靶因子间可能有相互作用；反之，则说明两者无相互作用。