实验五RNA的定量测定.pptVIP

RNA的定量测定——苔黑酚法（地衣酚）1、实验目的掌握苔黑酚法测定RNA含量的方法2、重点与难点实验原理利用分光光度计测浓度时，对照的选择3、苔黑酚法原理从化学组成来说，RNA由碱基、磷酸和戊糖组成。在酸性条件下，戊糖转化成糠醛，其可与苔黑酚生成绿色复合物，反应如下：这种复合物在670nm波长处有最大光吸收。当RNA的浓度10～100ug／ml范围内，其浓度与光密度值成线性关系。样品中少量脱氧核糖核酸(DNA)存在对测定无干扰，蛋白质、粘多糖在含量高时会干扰测定。4、实验操作4.1．标准曲线的制作取6支试管，按下表1编号加入试剂。表l.制作RNA标准曲线时各试剂用量试剂加完后，摇匀，置沸水浴中煮45min。冷却后，在670nm波长处测各管光密度值。以A670为横坐标，每管标准液浓度为纵坐标，绘制标准曲线。4.2．样品中RNA的测定取1支试管，加入2.Oml样品液，再加2.0ml苔黑酚试剂，按标准曲线制作方法，测得吸光度值后，折算成浓度。注：样品液即上次实验提取的酵母RNA。5、本方法的干扰物及其去除方法(1)戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰；某些己糖也对本法有干扰（糖经浓无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍生物，在浓无机酸作用下，与苯酚生成缩合物）；去除方法为，低浓度乙醇沉淀法和醋酸钾沉淀法，提高缓冲液中