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3-*（1）T4DNA聚合酶的性质3.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性（降解单链更快）。①来源②酶活性3-*③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’?5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。3-*5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’3-*（2）T4DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用3’?5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’?3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。①补平隐蔽的3’末端②DNA3’末端标记酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’?5’外切）DNA酶切片段T4DNA聚合酶（5’?3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’内切酶切无dNTPs4.T7DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：①T7基因5编码的大亚基：有5’?3’聚合酶和3’?5’外切酶活性。②大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。（2）T7DNA聚合酶的特点①持续合成能力强一但与模板结合就会不间断地合成互补链，是目前已知持续合成能力最高的DNA聚合酶。②3’?5’外切酶活性高单链和双链都能降解。③不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍②进行末端标记①以大分子量DNA为模板的合成③补平隐蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法标记3’末端。与T4DNA聚合酶相同。合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。同裂酶：指来源不同但识别和切割相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。如，限制酶HpaⅡ和MspⅠ的识别序列均为：5’-CCGG-3’同裂酶与同尾酶同尾酶识别和切割序列不同但产生相同的粘性末端。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。同裂酶与同尾酶5’-?GATC----3’3’----CTAG?-5’Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A限制性内切酶切与DNA重组的操作：用同一种限制性酶处理不同DNA片段，会形成同样的黏性末端，可进行重组。DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度（5）影响限制性内切酶活性的因素①纯化DNA②加大酶的用量③延长保温时间④扩大反应体积（20?l）一般采取大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。3.DNA的分子结构DNA的分子结构有三种超螺旋结构、线性结构、单链开环结构是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045255.酶切消化反应的时间和温度限制性内切酶储存在含50%的甘油缓冲液中，酶切时甘油的浓度不应超过1/10体积。否则对酶活性有抑制作用。6.反应体积和甘油浓度质粒酶切鉴定通常设定反应体积为10-20μl,质粒大量酶切通常设定反应体积为8