茶树生物技术-基因操作主要技术.pptVIP

琼脂糖凝胶电泳（EB染色）GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶。该酶基因为管家（housekeeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，故被广泛用作抽提totalRNA，poly(A)+RNA，Westernblot等实验操作的标准化的内参。常用的内参有，ACTB（β-actin、β-肌动蛋白）、GAPDH或18S等。目的是在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温差等所造成的误差。22263034五、实时荧光定量PCRrealtime-PCR实时荧光定量PCR与常规PCR的差别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析三个关键词：实时，定量，荧光PCR分四个阶段如何定量？Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。定量原理

确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量荧光化学SYBRGreen1TaqManTaqManSYBRGreenI工作原理

SYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未结合SYBRGreen1dye变性:无荧光信号SYBRGreenI应用范围起始模板浓度定量融解曲线分析---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体基因型分析SYBRGreenI优点SYBRGreenI缺点由于实时荧光定量PCR是建立在模板初始浓度与CT关系的基础上，因此为了保证样本具有准确可重复的实验结果，条件优化就显得非常重要。优化的实时荧光定量PCR结果有以下特点：线性的标准曲线（R20.980）高扩增效率（90%~110%）（1）标准曲线：将样品的cDNA模板稀释成一系列浓度梯度进行PCR反应，用模板稀释倍数的log值对每个稀释样品的CT值作图，两者呈递减的线性关系。标准曲线的R2值显示实验数据满足衰减的线性程度，即数据的线性程度。线性用来衡量重复样品数据是否一致和不同拷贝数的初始模板是否具有相同的扩增效率。标准曲线如图3-1所示，三个基因的标准曲线都呈递减的线性关系，并且R2值都满足大于0.98的要求，扩增效率都在90%~110%的范围之内，说明优化的PCR条件和体系复合实验要求，重复性好，可以使用2-ΔΔCT方法来计算CsICE1和CsCBF1受到冷诱导后的相对表达量。GAPDH扩增效率E=101.3%R2=0.985CsICE1扩增效率E=97.2%R2=0.991CsCBF1扩增效率E=106.2%R2=0.986图3-1三个基因的实时荧光定量PCR标准曲线可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性（即DNA熔解），荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次倒数与温度作图，在扩增产物的熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链碱基对分离50%的温度），用这个特征峰可以将特异产物与其他产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度熔解。（2）熔解曲线：CsICE1和CsCBF1的实时荧光定量PCR熔解曲线只有一个特征峰，说明两个基因的引物特异性好，PCR反应中没有产生引物二聚体等非特异性产物低温诱导条件下CsICE1与CsCBF1的表达分析3实验材料：龙井43和舒茶早两个茶树品种，每个品种都选取一棵成年茶树上的若干健壮枝条，清水培养。其中一部分放置于20℃作为常温对照，另外一部分放于4℃光照培养箱，分别于3h、6h、12h、24h、36h和48h后取嫩