PCR 和凝胶电泳分析和总结.docxVIP

分子生物学技术

实验一、实验二

基因的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测

1、实验目的

本实验通过学习用PCR扩增技术来获取特异性的基因DNA，以及扩增DNA的琼脂糖凝胶电泳检测技术，掌握有关的技术原理和实验方法。

2、实验原理

特异性基因的PCR扩增：

PCR扩增是指直接以待扩增的DNA为模板，加入特异性的一对引物、四种脱氧核糖核苷酸以及TagDNA聚合酶等，进行DNA的合成反应。

琼脂糖电泳：

琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。

琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围

琼脂糖凝胶浓度

线形DNA的最佳分辨范围（bp）

0.5%

1,000～30,000

0.7%

800～12,000

1.0%

500～10,000

1.2%

400～7,000

1.5%

200～3,000

3、材料、试剂及器具

材料

DNA模板

试剂

4XdNTP，Taq酶buffer，一对引物，TaqDNA聚合酶，琼脂糖，0.5*TBE。

器具

1

分子生物学技术

PCR管，移液器，1.5mlEppendorf管，PCR管架,Eppendorf管架，PCR仪,

电泳仪；紫外检测仪；水平电泳槽；一次性手套。

4、操作步骤

特定基因DNA 的扩增

配模板DNA液

H2O 15.3μl

dNTP(10mM) 0.5μl

10×TaqBuffer 2μl

引物1(10μM) 0.5μl

引物2(10μM) 0.5μl

Template 1ul

TaqDNApolymerase 0.2μl

==========================

Total 20μl

加入1ul的模板DNA。对照组的模板为ddH2O。

进行PCR反应。按照下列反应条件进行：

预变性： 95℃ 5min

变 性： 95℃ ？s

退火反应：

（Tm-5）℃

？s

引物延伸：

72℃

1kb/min,

循环数：

30个循环

补平反应：

72℃

5min。

琼脂糖电泳

1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；

1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；

2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干

粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般30ml,60ml,100ml）；

3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的溴化乙锭

终浓度为0.5ug/ml，轻轻摇匀，倒入电泳槽中，待其凝固；

4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；

5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；

6.在DNA样品中加入1×体积的载样缓冲液（loadingbuffer），混匀后，用枪将样品混合

液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；

2

7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一

7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一

端为负)。一般120V电压，电泳20～40min即可；

8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；

9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

5、注意事项

特定基因DNAPCR扩增的时候，由于各种成分的含量相对小，因而应先配成母液再分装。

试验过程小心谨慎,不允许因为实验操作带来的失败结果。

试验仪器的使用,试验过程详细讲解。

进入实验室后保持实验室的安静和整洁。

写出实验报告（格式：实验题目、实验内容、实验方法、实验结果、讨论与分析）。

实验结束后分组按组，搞好实验室卫生。

实验三 质粒DNA的分离提取、鉴定

一、实验目的

了解基因工程操作中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法，并且能够进行鉴定。

二、实验原理

碱变性抽提质粒DNA是根据质粒DNA与染色体DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱（NaOH）及表面活性剂（SDS）使细胞破壁、膜，释放出胞内染色体DNA、质粒DNA及其它物质。通过一系列的纯化过程：高盐除去核DNA，苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类，然后用乙醇（或异丙醇）沉淀出质粒DNA