附件1：《包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测 胶体金免疫层析法》征求意见稿.doc

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DBFORMTEXT34

FORMTEXT安徽省地方标准

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FORMTEXT包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测

胶体金免疫层析法

FORMTEXTRapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingwater

Colloidalgoldimmunochromatographyassay

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FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施

FORMTEXT安徽省市场监督管理局???发布

DB34/XXXX—XXXX

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由安徽省产品质量监督检验研究院提出。

本文件由安徽省市场监督管理局归口。

本文件起草单位：安徽省产品质量监督检验研究院、安徽省食品药品检验研究院、安徽蓝蓝矿泉水有限公司。

本文件主要起草人：XXX、XXX

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包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法

范围

本标准规定了包装饮用水中铜绿假单胞菌的胶体金免疫层析快速检测方法。

本标准适用于包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB8538食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法

术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

原理

本方法采用夹心免疫层析原理。样品中的铜绿假单胞菌经滤膜过滤富集，超声处理提取DNA。提取的DNA模板，经过PCR扩增，得到大量的扩增产物。由于上下游引物分别修饰了异硫氰酸荧光素（FITC）和生物素（biotin），双链的FITC端可以与胶体金上的FITC抗体结合，而修饰biotin的一端可以与试纸条检测线（T线）上的链霉亲和素（SAV）结合，在T线形成三明治结构从而导致检测线（T线）颜色深浅的变化，通过检测线（T线）与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中的铜绿假单胞菌进行定性判定。

试剂或材料

除另有说明外，所用试剂均为分析纯。

水

GB/T6682，二级水。

铜绿假单胞菌

标准菌株。

三羟甲基氨基甲烷（Tris）

盐酸（HCl）

乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na·2H2O）

氢氧化钠（NaOH）

Tris-HCl溶液

称取Tris（5.3）6.06g，加水（5.1）40mL溶解，滴加HCl（5.4）约2.1mL调pH至8.0，定容至50mL。

EDTA溶液

称取EDTA-2Na·2H2O（5.5）9.306g，加水（5.1）35mL，剧烈搅拌，用1gNaOH调pH至8.0，定容至50mL。

TE缓冲溶液

量取1mLTris-HCl溶液（5.7）于100mL容量瓶中，再加入0.2mLEDTA（5.8）溶液，定容至100mL。4℃保存。

铜绿假单胞菌菌悬液

用接种环挑取平皿上培养20h～24h的铜绿假单胞菌标准菌株（5.2）典型菌落，接种到营养肉汤中，37℃±1℃培养18～20h，即为铜绿假单胞菌菌悬液，活菌数应达到1×108CFU/mL～5×108CFU/mL。

引物

上游引物：5’-Biotin-GGCATTCAGATTGCTGCTCG-3’

下游引物：5’-FITC-ACCGCCGTCAGAATCAGTTT-3’。

仪器和设备

PCR仪。

移液器：0.5μL~10μL，10μL~100μL，100～1000μL。

旋涡混合器。

超声波水浴仪。

电子天平：感量分别为0.01g和0.01mg。

胶体金免疫层析检测试纸条。

无菌滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μm。

离心管：200μL、1.5mL、50mL。

分析步骤

水样过滤

将250mL水样通过孔径0.45μm的滤膜过滤，滤膜备用。

DNA提