3-海洋生物综合实验-备课笔记.docxVIP

实验一海水鱼类组织DNA的提取

一、实验原理

在浓氯化钠（12mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化钠（0.14mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。将抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA或（RNA）即与蛋白质分开，可用氯仿一异戊酵将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。为了防止DNA或（RNA）酶解，提取时加入EDTA（乙二胺四乙酸）脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收，在每毫升含DNA20-400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比。

二、实验试剂

（1）0.14molL氯化纳-0.05mol/LpH7.0柠檬酸钠缓冲液：先配制0.05mol/LpH7.0柠檬酸钠缓冲液，再称取一定量固体氯化钠溶于此缓冲液中。使最终氯化钠浓度为0.14mol/L。

（2）1molL氯化钠溶液。

（3）氯仿-异戊酵混合液。

（4）80%、90%乙醇及无水乙醇。

（5）二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75亳升，混匀备用。临用前加入l毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。

三、实验器具

解剂器具、玻璃匀浆器、普通离心机、培养皿、量简（50ml、100ml）；烧杯（100ml、250ml）、磨口试剂瓶（150ml）、滴管、玻璃棒、台秤、真空干保器、肝脏、试管及试管架、移液管（1，2，5毫升）、恒温水浴、可见光分光光度

四、实验过程

（1）将活鱼杀死后，迅速取出肝脏，置于冰浴中的培养皿中，剔除结缔组织，用少量冰冷的0.14molL氯化钠-0.05mol/LpH7.0柠檬酸钠缓冲液洗去血污，用滤纸吸干后称重，约取20g剪碎后置玻璃匀浆器中，加入相当于2倍干重的冰冷的0.14mo1VL氯化钠-0.05mol/LpH7.0柠檬酸钠缓冲液，在冰浴中反复研磨，制成细胞匀浆。

（2）将肝脏细胞转移至离心管中，以三千转每分钟离心十五分钟，弃去上清液，所得沉淀再用两倍质量的0.14moL氯化钠-0.05mol/LpH7.0柠檬酸钠缓冲液研磨并如前离心两次。

（3）讲细胞核沉淀转移到100ml烧杯中，加入6倍质量的1molL氯化钠溶液，充分搅匀，置于冰箱中过夜，可得到半透明的粘稠状液体，将下层沉渣弃去。用滴管慢慢滴入1l倍体积的冰冷蒸馏水中，此时有白色丝状物（DNA核蛋白）析出，用玻璃棒搅起，沥干水分，再溶于八倍质量的lmol/L氯化钠溶液中，迅速搅拌加速溶解。

（4）将上述溶液导入巨磨口塞的250ml试剂瓶内，再加入等体积的氯仿-

异戊醇混合液，剧烈震荡5分钟，转移至离心管内，在三千转下离心十五分钟，这时可见三层。上层是含有DNA和RNA核蛋白的水层，下层是氯仿-异戊醇有机溶剂层，中间夹着的是变性蛋白质凝胶层。吸出上面的水层，再用氯仿-异戊醇如前进行脱蛋白，直至界面处不再出现蛋白质凝胶为止。量取水层体积后再倒入2倍体积的冰冷的95%乙醇中，再用玻璃棒搅起白色丝状物（DNA沉淀），沥干，先用80%乙醇洗涤两次，再用无水乙醇洗涤一次，所得DNA沉淀置于真空干燥器内干燥，称重。

五、注意事项

1、二荣胺法测定DNA含量灵敏度不高，待测样品中DNA含量低于50mg/L即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。

2、样品中含有少量RNA并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胶反应形成有色化合物，故能干扰DNA定理。

3、研磨样品一定要充分，研成细浆状。

4、第一次离心后，上清液表面的一层脂肪可通过快速倒去上清液除去，附在沉淀中的脂肪则务必用稀盐溶液清洗，清除干净。

5、操作过程中的所有搅拌要求轻和慢（但太慢也不好），以免搅断DNA细丝。

实验二PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳

一．原理：

PCR：是一种选择性扩增DNA或RINA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结裤交引物要复杂得