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单克隆抗体制备实验过程
一、免疫动物
免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，
使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
说明：弗氏完全佐剂；弗氏不完全佐剂；,北京康碧泉公司研制
FCAFIA,Quickantibody
的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM,存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS
1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小
鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如
果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的
情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B
细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合(Cellfusion)
【材料和试剂】
(1)
骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或
体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
(2)3
免疫小鼠脾细胞悬液取天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，？分离
血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3〜5min。无菌操作取出
脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将
脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3〜5
个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾
脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml,1000r/min离心5min,
弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全
培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得〜2
x108个脾细胞。
(3)
饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镣从后腹掀起
腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完
全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔
内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，
随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5mlHAT
培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养
基，使细胞浓度为2X105/ml,备用。
(4)
主要试剂的配制
①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM
(DulbercoModifiedEaglesMedium)两种基础培养基，配好后过滤除菌()，分装，4c保存。
不完全RPMI-1640培养基：
RPMI-1640培养基原液96ml
100X.溶液1ml
双抗溶液1ml
%NaHCO3液1-2ml
HEPE豁液1ml
DMEM!
不完全养基：
DMEM
超纯水或四蒸水980ml
NaHCO3
双抗溶液10ml
100X.溶液
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