动物基因操控技术.pptx

动物基因操控技术;转基因动物技术

基因敲除技术

基因修饰技术;一、转基因动物的概念;1.1转基因技术发展简介;

转基因超级鼠

1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～3倍，体积大一倍。;1.2转基因的方法;1)显微注射法:将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。;2)逆转录病毒感染法：最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗传信息以RNA分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。;3)胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。;1.3转基因动物的应用前景

1、研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质。

2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。

3、改善动物生产性能，提高动物育种效率。

4、作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。;二、基因敲除动物的概念;2.1基因敲除的方法;1)利用基因同源重组进行基因敲除;1.1打靶载体的构建;现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。;1.3外源DNA导入;1.4基因打靶的筛选方法;1.5ES细胞的囊胚注射;将囊胚移植到假孕母鼠子宫内;通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。;2)条件性基因敲除法;诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控??Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。

常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型(图)；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。;四环素诱导的条件性基因敲除过程示例图;三、靶向基因修饰新技术——TALEN和CRISPR;1989年，植物病原体Xanthomonassp.avrBs3基因被克隆

2.2007年，发现avrBs3-TA序列特异性核酸结合特性

(Romer,P.etal.Science2007；Kay,S.etal.Science2007)

3.2009年，avrBs3-TA氨基酸序列与核酸靶序列对应关系被破译

(MatthewJ.MoscouandAdamJ.Bogdanove.Science2009)

4.2011年，TALEN斑马鱼和大鼠基因敲除个体出生（重大技术突破）

（Tesson,L.,C.Usal,etal.NatureBiotechnology2011；PengHuangetal.NatureBiotechnology2011）

5.2012年，TALEN实现斑马鱼基因敲入；猪和牛胚胎基因敲除成功

(Bedell,V.M.,Y.Wang,etal.Nature2012；Carlson,D.F.,W.Tan,etal.PNAS2012)

6.2013年，TALEN小鼠基因敲除和敲入个体分别产生

(Sung,Y.H.,I.J.Baek,etal.NatureBiotechnology2013);TALEN基因修饰技术原理;TALEN基因修饰技术原理;TALEN基因敲除基本流程;构建TAL靶点识别域;靶点识别单元串联;TALEN表达质粒构建;真核表达TALEN质粒对;（2）CRISPR/Cas9技术发展史;CRISPR/Cas9技术工作原理;CRISPR/Cas9基因修饰技术流程;MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystem