猪CD1d蛋白多克隆抗体的制备及应用.pdfVIP

中国农业科学2024,57(8):1620-1628

ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2024.08.015

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

猪CD1d蛋白多克隆抗体的制备及应用

刘传霞，陈欣，王晓，李雪雯，李婷婷，翁长江，郑君

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病预防控制国家重点实验室/国家非洲猪瘟专业实验室/基础免疫创新团队，哈尔滨150069

摘要：【目的】制备猪源CD1d的多克隆抗体，为探究猪CD1d蛋白在非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）感

染过程中的功能奠定基础。【方法】利用PCR方法扩增了猪CD1d基因，并将其同源重组至pGEX-6p1载体中，构建了原核重

组表达质粒pGEX-6p1-CD1d。将重组质粒转化E.coliBL21（DE3）并用IPTG进行诱导表达，表达的GST-CD1d重组蛋白经

SDS和Westernblot（WB）方法鉴定，SDS结果显示约50ku处有一条明显的条带，该蛋白以包涵体形式表达。

然后利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法进行蛋白纯化，将纯化的GST-CD1d蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，将纯

化的蛋白免疫新西兰大白兔，采用颈背部多点皮下注射，免疫剂量为200μg/只，首免后第3周和第5周分别进行二免和

三免，均采用弗氏不完全佐剂乳化，方法和剂量与首免相同。三免后第7天，通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进

行第四次免疫，一周后心脏采血。该抗体经ProteinG亲和层析纯化后冻存于-80℃冰箱。通过WB和间接免疫荧光（IFA）

鉴定瞬时转染表达的外源CD1d蛋白和猪原代巨噬细胞（PAMs）表达的内源CD1d蛋白的表达与细胞定位情况。同样，制备的

CD1d抗体可以将外源瞬时转染表达的CD1d通过IP拉下。为了探究CD1d在ASFV感染早期的情况，将ASFV接种于PAMs，制

备ASFV感染0、15、30、60min的样品，以CD1d为一抗，通过WB检测了CD1d蛋白的表达情况。在HEK293T细胞共转

pCAGGS-HA-CD1d和pCAGGS-Flag-CD2v质粒，24h后收取细胞裂解，加入Flagbeads过夜结合蛋白，通过WB检测互作情况

染，同时，质粒共转染于共聚焦小皿中的HEK293T细胞，用标签抗体对其进行孵育，选择相应的荧光二抗，通过激光共聚焦

显微镜观察CD1d与CD2v在细胞中共定位情况。采用Co-IP验证CD1d与ASFV外囊膜蛋白CD2v的相互作用。【结果】原核表

达的GST-CD1d蛋白以包涵体形式表达在感受态细胞中，分子质量约为35ku；实验兔4次免疫CD1d重组蛋白后采血并分离

血清，纯化的抗体经SDS检测在45和25ku处各出现一条特异性条带，分别为CD1d抗体的重链与轻链。以纯化的CD1d

蛋白作为免疫原制备的兔抗CD1d抗体包含重链和轻链，且具有较好纯度；该抗体能够通过WB和IFA鉴定瞬时转染的外源以

及PAMs内源CD1d蛋白的表达和细胞定位。进一步检测结果显示，ASFV感染PAMs后，CD1d蛋白表达水平明显增加，并且

WB和IFA结果显示CD1d与ASFV编码的外囊膜蛋白CD2v存在相互作用和共定位。【结论】通过原核表达技术制备了CD1d的

抗体，为进一步探究CD1d蛋白在ASFV感染过程中的生物学功能打下了基础。

关键词：CD1d蛋白；原核表达；多克隆抗体；非洲猪瘟病毒；CD2v蛋白

PreparationandApplicationofPolyclonalAntibodiesAgainstPig

CD1dProtein

LIUChuanXia,CHENXin,WANGXiao,LIXueWen,LITingTing,WENGChangJiang,ZHENGJun

DivisionofFundamentalImmunology,NationalAfricanSwineFeverPara-ReferenceLaboratory,StateKeyLa