实验三革兰氏染色法.pptx

试验三革兰氏染色法

一、试验目的学会细菌制片措施；掌握革兰氏染色措施及成果判断。

二、试验原理革兰染色法是由丹麦医生ChristianGram于1884年创立的一种细菌鉴别染色法，根据染色成果将细菌提成两大类，即革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-），此有助于细菌鉴别、分析细菌的构造特点、致病性和选用抗菌药物提供根据。

二、试验原理结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染涂片固定

二、试验原理

二、试验原理革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌

二、试验原理革兰氏染色的机理机理：与细胞壁厚薄、肽聚糖和类脂含量有关G+菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，导致结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，番红复染后仍呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其构造收缩，并且含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，番红复染后呈红色。

三、试验器材及试剂枯草芽孢杆菌、大肠杆菌18～24h培养物革兰染色液一套（草酸铵结晶紫染液、卢戈碘液、95%乙醇、番红染液）酒精灯，玻片，接种环，吸水纸，香柏油，二甲苯，显微镜。

四、试验环节1.涂片2.干燥3.固定4.染色水洗、吸干5.镜检

四、试验环节1、涂片取洁净载玻片1片，将1滴纯水置于玻片上，接种环灭菌后取菌少许，与水滴混匀并涂成直径约1cm的薄膜。如用液体培养物涂片，可直接取培养物涂于玻片上，不加纯水（注意滴纯水和取菌时不适宜过多且涂抹要均匀，不适宜过厚）。有菌的接种环应立即在火焰上烧灼灭菌。

四、试验环节2、干燥将涂片放空气中自然干燥，或在离火焰较远处烘干，切勿高温烘烤，因温度太高会破坏菌体形态。3、固定手持载玻片一端，将涂片在火焰外焰上持续通过3个来回，每个来回约1s，就可固定标本，直到手背试触涂片背面热而不烫为宜。

四、试验环节4、染色①初染：滴加结晶紫染液1～2滴于标本面上，染色1min，轻轻水洗，甩干；②媒染：滴加卢戈碘液1～2滴于标本面上，染色1min，轻轻水洗，甩干；③脱色：滴加95％酒精1～2滴于标本面上，频频倾动玻片，直到不再溶下染料为止，约30s，视标本片材料厚薄而增减时间，然后水洗，甩干；④复染：加番红染液1～2滴于标本面上，染1min，水洗后吸干。

四、试验环节5、镜检用毛边纸或滤纸轻轻吸干(宝贵标本应自然干燥)，待标本充足干燥后加油，用油镜观测并判断细菌的染色成果。6、试验后处理

用二甲苯擦油镜镜头后用擦镜纸擦干，整顿、清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放入消毒缸中消毒5min后清洗。

四、试验环节1234结晶紫碘液酒精番红

五、注意事项1、玻片要洁净无油，否则菌液不易涂开。不适宜选用厚玻片，以免标本观测时视野难调清。2、涂片时注意大小、位置、厚薄等问题。3、干燥一般用自然干燥法，必要时可在酒精灯火焰上方热空气中烘干，切勿紧靠火焰。4、固定的目的是杀死细菌，使其蛋白凝固粘附在玻片上，变化细菌对染料的通透性便于着色，要注意固定的措施是标本向上在酒精灯的外焰上来回3次，约1s一种来回，3s后以手背试贴玻片热而不烫为宜。

五、注意事项5、染色时注意看清染料名称，按序进行、滴加染料以能覆盖涂片为度不适宜过多，要掌握好染色时间，尤其是酒精脱色时间，不适宜过长或过短。染色中除脱色时摇动玻片外均要端平玻片或将其静放台面上。染色过程中，不可使染液干枯。6、水洗切勿先倒去染料，而是用较小水流冲洗在玻片一端，用水流将它们缓缓带走，防止直接冲洗菌膜处，要切忌将未经火焰固定的标本染色水洗。

五、注意事项7、选用适龄培养物，以18～24小时为宜，否则影响染色效果。8、细菌染色标本观测后应放入规定的消毒缸中消毒处理。

六、思索题1、哪些环节会影响革兰染色成果的对的性？2、革兰染色有何实际意义？