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ASmall-MoleculeProtein–ProteinInteractionInhibitorofPARP1ThatTargetsItsBRCTDomain

演讲：方志军药学121方志军核心方法：化学交联技术(chemicalcrosslinking)

文献信息刊名：AngewandteChemie(InternationalEditioninEnglish)ISSN号：1433-7851影响因子:2013年度:11.3362012年度：13.7372011年度：13.4552010年度：12.73分区：文献标题：ASmall-MoleculeProtein–ProteinInteractionInhibitorofPARP1ThatTargetsItsBRCTDomain作者：NaZ;PengB;NgS;PanS;LeeJ;ShenH;YaoSQ.出版日期：2015

PART1化学交联技术的简单了解

技术背景蛋白质作为一种生物高分子在生命活动中起着重要的作用。尤其是在人类基因组测序完成以后，人们认识到，对基因的了解并不能完全诠释全部的生命现象，毕竟蛋白质是生命现象的直接体现，是生命活动的执行者。生命表现出多因素、系统性、动态性的特征，蛋白质问的相互作用及功能、构象变化参与和影响着生命的全过程，是当前生命科学研究的一个热点。常用的研究蛋白质相互作用的方法有：串联亲和纯化(tandemffinitypurification)、免疫共沉淀(co—immunoprecipitation)、酵母双杂交(yeasttwohybrid)、噬菌体展示(phagedisplay)和化学交联(chemicalcrosslinking)等化学交联技术的应用最为久远，而随着生物质谱的出现，其应用面大为扩展，与其他方法联合使用，结果互相验证，是研究蛋白质相互作用的有力工具。

技术概念化学交联反应：指在光、热、高能辐射、机械力、超声波和交联剂等作用下，大分子链间通过化学键联结起来，形成网状或体形结构高分子的过程。化学交联剂：指能够和蛋白质反应的带有双功能团的化学试剂。通过功能团和氨基酸残基反应，偶联两个蛋白质或者更多的蛋白质形成网状交联。功能团决定了交联剂的反应特异性。一种良好的化学交联剂-甲醛甲醛作为活泼的小分子醛基试剂，常用于病理标本的保存和组织化学分析中，它可以快速地渗透细胞膜，在细胞内产生广泛地蛋白质交联。

可能的反应机理：甲醛和精氨酸、半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸的氨基反应形成席夫碱的活泼中间体，再进一步与其他氨基酸残基反应，从而形成复杂的、网络状的交联产物

技术过程样品的交联反应交联产物纯化质谱分析数据处理a、根据研究的目的，选择合适的化学交联剂，在生物样品中进行化学交联反应，产生目的交联产物b、由于蛋白质分子的复杂性、生物样品中蛋白质成分的多样性和化学交联剂特异性的相对性，以及反应时微环境的pH、离子强度等因素的影响，反应的复杂度大为提高，目的交联产物仅是其中非常有限的一部分。用蛋白酶消化目的交联产物，使之成为质谱所能检测的多肽，此时，该多肽混合物中含有发生蛋白质相互作用的分子间的交联产物、同一蛋白质内的交联产物及未修饰的多肽片段，使样品的复杂度进一步提高。c、利用LC—MS／MS在线分离、分析和专业软件解析，就可以最终确定检测样品中存在的蛋白质相互作用。

技术优缺点优点：1、结合生物质谱的高解析能力，快速、高通量地获取蛋白质高级结构信息，逐渐成为研究蛋白质相互作用的一种很有前途的方法。2、能够“捕捉”到某个状态下的微弱的、瞬时相互作用。缺点：交联技术更多的是一种实验性的过程，利用质谱解析其结果还有很大的局限，这就需要结合其他方法共同研究蛋白质的相互作用。

PART2结合文献理解化学交联技术

PhaseI：潜在靶标BRCT区的生物学性质PARP1：人类PARP的蛋白家族成员之一，分子量是113kDa，存在于细胞核中的一种酶，主要参与DNA单链断裂和双链断裂的修复。此外还有调控转录、染色体稳定、细胞分裂、分化和凋亡等多种生物学功能。通过干扰PARP1的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI作用），来抑制酶的活性，因此PARP1成为了当今癌症治疗中炙手可热的靶标之一,相应的药物称为PARP1蛋白小分子抑制剂，例如Olaparib，DPQPARP1蛋白的六大结构区域 PARP1蛋白有6个结构区域，现在使用