qPCR实验步骤分析和总结.docx

Q-PCR实验流程

一、总RNA抽提

细胞培养皿中细胞样品用1XPBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml

Trizol(invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5mlRNasefreeEP管中使细

胞充分裂解，室温静置5min;

组织样品用液氮充分研磨，加入1mlTrizol(Invitrogen)溶液，混匀，室温放

置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)

加入200μl氯仿（5X），剧烈振荡混匀1min，使水相和有机相充分接触，室

温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序

排好，与第一步的顺序一致)

4℃下，14000g离心5min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新

的RNasefreeEP管;(用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面

上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)

沉淀RNA：加入等体积（1:1）异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用

振荡器混匀)，室温静置10min;

4℃下，14000g离心15min，收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，

应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14000g离心10min，收集RNA

沉淀)，去上清;

用75%乙醇洗涤两次，12000g离心5min(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，

不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀)，弃去上清液，空甩一次，以完全去除乙醇，

开盖晾3~5min，反复2次，挥干，使样品变透明。

视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。，打散，备用。

OligdTRNADEPC

OligdT

RNADEPC水

1ul

4ul

3ul

在RNasefree的PCR管中配置下列溶液.

将上述溶液吹打均匀，置70℃保温5min，使RNA变性。随后4℃，保持5min，

以防止RNA复性;

在该PCR管中加入下列试剂

（M-MLVReverseTranscriptate）E

（M-MLVReverseTranscriptate）E

dNTP

Mgcl

1ul

4ul

3ul

2

M-MLVRT5Xbuffer

4ul

将上述20μl反应溶液混匀，空甩，开始反转录：25℃保温10min;

42℃保温60min;

70℃保温15min;

4℃，∞。三、调cDNA浓度

反转结束后，每个样品加入80ul的超纯水，混匀，用微量分光光度计检测浓度，先用超纯水校准。

20ul（cDNA）+80ul超纯水→100ul（cDNA）然后将各样品的cDNA浓度调至150ng/ul.

初始浓度X100=150X（水+100）

加水量=初始浓度X100/150–100.

四、PCR:

酶E

酶E

模版引物水

10ul

2

ul

20ul体系

2.5ul

5.5ul

离心甩匀后，放入PCR扩增器中，设置反应体系。

五．电泳

配胶：1.5%

80ml1XTBE+1.2g琼脂

微波3min，使之澄清，加入8ulGelred摇匀（与TBE1:10000），加入板上，排除气泡，放入梳子，静置。

垂直拔出梳子，倒入TBE使之没过所有孔，上样，注意每行预留Marker位置，加样完成后，120V跑胶。