高效液相色谱柱基础知识.ppt

关于高效液相色谱柱基础知识色谱柱的构造色谱柱由柱管、填料压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管。为提高柱效，减小管壁效应，管内壁要求有很高的光洁度，不锈钢柱内壁多经过抛光。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2~20μm(5~10μm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。第2页,共21页，星期六，2024年，5月按用途分类分析型常规分析柱，内径2~5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长10~30cm,粒径3.5或5μm，；窄径柱（又称半微柱semi-microcolumn），内径1~2mm，柱长10~20cm；毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2~0.5mm；制备型半制备柱，内径＞5mm；实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm；生产制备柱，内径可达几十厘米。色谱柱的种类第3页,共21页，星期六，2024年，5月按分离机制分类吸附型色谱柱化学键合相色谱柱(分配型）正相键合相色谱柱反相键合相色谱柱离子交换色谱柱凝胶色谱柱亲合色谱柱手性色谱柱色谱柱的种类第4页,共21页，星期六，2024年，5月色谱柱的种类按填料基质分类硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。具有高强度，不会在溶剂中收缩或膨胀。能提供一个含有游离硅羟基的表面，可以通过硅烷化技术键合上各种配基，制成正相、反相、离子交换、分子排阻色谱用填料。适用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定，易溶解。第5页,共21页，星期六，2024年，5月高分子聚合物常用的是以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的球形填料。压力限度比无机填料低；在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱；聚合物基质在流动相发生变化时会出现膨胀或收缩，对于小分子化合物柱效低；主要用于大分子化合物，常制成凝胶柱或离子交换柱。色谱柱的种类第6页,共21页，星期六，2024年，5月化学键合相色谱柱定义：将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。种类非极性键合相（反相）：键合相表面基团为非极性羟基，如C18、C8、C3、乙基、甲基与苯基。中等极性键合相：常见的为醚基和二羟基键合相，既可做正相又可做反相色谱的固定相，视流动相极性而定。极性键合相（正相）：常用的为氨基、氰基、二醇基键合相。第7页,共21页，星期六，2024年，5月化学键合相色谱柱的合成第8页,共21页，星期六，2024年，5月化学键合相一般采用微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷烃氯硅烷与硅胶表面的游离硅羟基反应，形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。由于空间位阻效应和其它因素的影响，使得大约有40~50%的硅醇基未反应。残留硅羟基可以减小非极性键合相表面的疏水性，对极性溶质（特别是碱性化合物）产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化，使碱性组分的峰形拖尾。化学键合相色谱柱的合成第9页,共21页，星期六，2024年，5月端基封口：为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，称端基封口，以提高键合相的稳定性，改善脱尾。键合相的键合量常用含碳量(C%)或覆盖度来表示。覆盖度：指参与反应的硅羟基数目占硅胶表面硅羟基总数的比例。除硅－碳杂化硅胶外，一般硅胶基质的pH适用范围为pH2~8，低pH引起键合相水解脱落，高pH引起硅胶溶解。化学键合相色谱柱的合成第10页,共21页，星期六，2024年，5月基质的性质普通硅胶填料：pH2～8，柱温≤60℃聚合物填料：pH2～12，柱温≤150℃杂化硅胶填料（XTerra,XBridge）：pH2～12，柱温≤90℃Agilent柱：Ecilpse或StableBond，pH1~3ZORBAXExtend-C18，pH9~12,基质的颗粒度颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)，分离度越好，柱压越高(渗透性差)，常用5μ。基质的颗粒分布颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差)基质的颗粒形状球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型（不规则形状）：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀，谱带扩展。化学键合相色谱柱的性质第11页,共21页，星期六，2024年，5月基质的平均孔径/孔体积平均孔径与被测物分子量的关系化学键合相色谱柱的性质第12页,共21页，星期六，2024年，5月含碳量含碳量越高，保留时间越长高含碳量