细胞周期和细胞凋亡.pptx

细胞周期和细胞凋亡技术;第一节细胞增殖周期;细胞周期;G1D(分化态);二、细胞周期各时相的特点;１.G1期细胞的生长;2.G1期细胞的增殖状态;(二)S期:合成DNA

(三)G2期:

为M期的细胞分裂作好物质和能量贮备

(四)M期

把复制好的染色体平均地分到两个子细胞中去;二.细胞增殖与肿瘤;第二节细胞凋亡技术;一.细胞凋亡的特征;（2）细胞坏死（necrosis）;细胞凋亡与坏死的区别;特性推荐使用手段说明;1、透射电镜形态学观察法

收集细胞→PBS洗两遍→戊二醛固定→电镜切片

形态特点：

细胞膜起泡、出芽，染色体凝集，形成的凋亡小体。

缺点：

①只能定性不能定量

②标本处理过程复杂、设备昂贵，不适合作大批标本检测;2、扫描电镜形态学观察法;3、流式细胞分析仪

（FlowCytometry，FCM）;流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技术、空气计数、γ-射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计结合的一种大型的精密仪器，它通过测量在一定波长的激光激发快速流动的粒子（细胞或微粒）荧光和散射激光来获得粒子的一些成分及其变化情况，进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。

FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。;流式细胞仪与显微镜;基本原理;;利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。;;;应用FCM进行细胞凋亡定量检测

——单参数分析PI染色法;区分细胞碎片和凋亡细胞;优点：

快速准确，简单易行，所需样本少，可做大批量、定量凋亡标本的检测。;双参数分析;坏死细胞;AnnexinV/PI的双染色法检测凋亡细胞;优点：;三、凋亡调控基因及凋亡相关因子的检测;②促进细胞增殖的基因

如：c-myc、c-abl、ras相关基因;(二)凋亡调控基因和因子的检测方法;思考题;侧向散射光;前向散射光（FSC）：检测细胞大小

侧向散射光（SSC）：检测细胞内部结构

（胞浆内颗粒多少,核质比）

;根锯FSC/SSC，就可以分开全血样本中的淋巴细胞，单核细胞和中性粒细胞。;Laser;

;常用荧光染料的特性;超高频电晶体充电后振动→液流断裂为均匀的液滴→将液滴充以正负不同的电荷→当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转→落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。;DNA含量;AnnexinV-PI的双染色法检测细胞凋亡原理：;新月状;细胞核断裂成碎片;染色质浓缩，形成多种形态;图：细胞凋亡时超微结构的变化;由膜包裹的凋亡小体;染色质浓缩;DNAladder;（2）Bcl-2蛋白家族成员及生物学效应;Bcl-2、Bax和Bcl-xs三者形成一个凋亡调控系统;Bad：诱导凋亡，能和Bcl-2或Bcl-xl形成二聚体

Bad与Bcl-xl形成稳定的异二聚体后，使原来的的Bax-Bcl-xl解体，将Bax置换出来，形成Bax同源二聚体，启动凋亡。;AO和EB双染;概念：

Caspases(Cysteine-containingaspartate-specificproteases)：天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶—在靶蛋白的特异天冬氨酸残基部位进行切割。;Caspase家族的结构与分类：

有14个成员(Caspase1-14)

（1）凋亡启动亚类Caspase蛋白酶：

Caspase8，Caspase9，Caspase10。

（2）凋亡效应亚类Caspase蛋白酶：

Caspase2，Caspase3，Caspase6，Caspase7;2、参与死亡受体信号转导的接头蛋白：（死亡结构域蛋白deathdomainprotein）

TRADD：TNF受体相关的死亡结构域蛋白

TNF+TNFRI（死亡结构域）+TRADD—细胞凋亡

FADD：Fas相关的死亡结构域蛋白

FasL+Fas（死亡结构域）+FADD—细胞凋亡

TRAIL+DR4/DR5（死亡结构域）+FADD—细胞凋亡;FASL+FAS+FADD

死亡诱导信号复合物（DISC）

胞质中游离的pro-caspase8聚集到这个复合物上