伪狂犬病抗体检测专家讲座.pptx

试验四、伪狂犬病抗体检测

（阻断ELISA);酶联免疫吸附试验

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA);一、试验目标;二、试验原理;间接法（IndirectELISA）

阻断法（BlockELISA)

双抗体夹心法（SandwichELISA)

竞争法（CompetitiveELISA);（1）间接法测定抗体

A.将抗原吸附于固相载体表面；

B.加抗体,形成抗原-抗体复合物;

C.?加酶标抗体；

D.加底物。测定底物降解量＝抗体量。;显色;（2）阻断法测定抗体

A.?将抗原吸附在固相载体表面;

B.先加待检血清（抗体）,形成抗原-抗体复合物;

C.?再加酶标单抗；

D.加底物。;单抗;（3）双抗体夹心法测定抗原

A.将抗体吸附于固相表面;

B.加待检抗原，形成抗原-抗体复合物;

C.加酶标抗体;

E.加底物。底物降解量＝抗原量。;（4）竞争法测定抗原

A.抗体吸附在固相载体表面;

B.同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；

C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量差＝未知抗原量。;酶标板，酶标仪

包被缓冲液：0.025MpH9.6碳酸盐缓冲液

猪伪狂犬病毒（PRV）——抗原

样品稀释液：pH7.4PBS;阴性对照（EP管中，已稀释）

阳性对照（EP管中，已稀释）

样品——待测猪血清（EP管中，已稀释）

AP标识猪PRV单抗——酶标单抗（EP管中，已稀释）

洗涤液：含0.05%Tween200.01MpH7.4PBS（青瓶）;惯用酶及底物;底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液

底物溶液：TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30%H2O2，新鲜配制

终止液;1.抗原处理：;3.加待测血清：;取稀释好被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入100μl，置37℃温育30分钟。

洗板：甩掉板孔中溶液，每孔加入稀释好洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。

每孔加酶标单抗100μl，置37℃温育30分钟。

洗板：同时骤2。

显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混匀，室温（18-25℃）避光显色10分钟后。

终止：每孔加终止液1滴(50μl)（0.25%氢氟酸），终止反应。

10分钟内测定结果。采取波长630nm酶标仪测定OD值。

结果判定：试验成立条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.4。

S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值

假如S/N比值≤0.6，样品判定为PRV抗体阳性;

假如S/N比值≤0.7但0.6，样品可疑;

假如S/N比值0.7，样品判定为PRV抗体阴性。;五、结果与分析;预期结果;ELISA前血清样品37℃灭活30分钟。

在ELISA整个操作过程中，洗涤是非常主要步骤，目标在于预防引发非特异性吸附，洗涤时尽可能除去未结合抗原及杂质，用力甩干。

加入底物液后应室温避光，结果判断须在10分钟内。

试验中保持安定，不要随意走动、讨论不相关事情。;思索题