抗氧化测定方法（三种）.docVIP

实验一超氧阴离子自由基清除能力的测定

——抗氧化实验之一

一、目的要求

通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧阴离子自由基清除能力测定的方法。

二、实验原理

超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。

邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣?，02﹣?能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣?的浓度，清除02﹣?就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。

三、器材及试剂

（一）器材

恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。10ml比色管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。

（二）试剂

邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、BHT等。

（1）pH8.2的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）：50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9ml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。

（2）0.2mmol/L邻苯三酚溶液（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制）

四、操作步骤

（一）样品的测定

（1）先将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，在10mL的比色管中分别加入4mL（0.05mol/L）pH8.2的Tris-HCl缓冲液，置于25℃水浴中预热20min，然后加入25℃水浴中预热20min不同浓度样品液1mL，再加入在25℃水浴中预热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液1mL（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制），混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用浓HCl两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度（A样）。每管做三个重复，取平均值。.

（2）同上述过程，只是用1mL的蒸馏水代替样品液，测定结果为原始管（A原）。每管做三个重复，取平均值。

结果计算：

A原—

A原—A样

A原

02﹣?清除率（%）=×100%

注意：

A样参比：缓冲溶液4ml+1ml样液+1mlHCl（0.05mol/L）代替邻苯三酚溶液

A原参比：缓冲溶液4ml+1ml水代替样+1mlHCl（0.05mol/L）

（二）阳性对照试验

将抗坏血酸等抗氧化药品配制成梯度浓度，与提取样品一起进行抗氧化实验，进行结果对比，以判断样品的抗氧化能力。方法同样品的测定，只是将样品用抗氧剂代替即可。

实验二羟自由基清除能力的测定

——抗氧化实验之二

方法一：羟自由基（·OH）清除能力的测定——邻二氮菲-Fe2+氧化法

一、目的要求

熟悉羟自由基清除能力测定的原理，掌握操作方法。

二、实验原理

羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，可以发生电子转移、夺取氢原子和羟基化等反应，可以使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类都发生氧化，并损伤膜结构及功能，在研究自由基时，反应可通过水的辐射、光解及化学反应来产生羟自由基，Fenton反应是最常见的化学反应，Fenton反应是以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法。

邻二氮菲-Fe2+是一种氧化还原指示剂，其呈色变化可反映出溶液中氧化还原状态的改变。H2O2/Fe2+体系，通过Fenton反应所产生的羟自由基（HO·），邻二氮菲-Fe2+水溶液可被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+，从而使邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失，根据吸光度的变化，可推知系统中HO·的产量。

Fenton反应是以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法，其反应机理如下：

Fe2++H2O2→Fe3++OH–+?

羟自由基可以与抗氧化剂发生作用，由于邻二氮菲–Fe2+水溶液显橙红色根据邻二氮菲–Fe2+颜色的变化可利用分光光度法（536nm处特征吸收峰的变化）对抗氧化剂的抗自由基性能进行分析。

三、器材与试剂

（一）器材

恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。试管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。

（二）试剂

邻二氮菲、H2O2、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸