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2、设计一个酶的制备方案（50分）

胰蛋白酶的制备

1实验原理

胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被

肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间

的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其

酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最

稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋

白酶有稳定作用。重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，

胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的

块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶能催化蛋

白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基

所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键

或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的

敏感性次序为：酯键酰胺键肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化

合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简

称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯

甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）

测定酯酶活力。本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶

活力单位的规定常因底物及测定方法而异。从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般

是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原

理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐

析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐

析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，

以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹

性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及

弹性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般

经过2～3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到8000～

10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通

过亲和层析方法纯化。

实验试剂和器材

一、试剂

pH2.5乙酸酸化水；2.5mol/LH2SO4；5mol/LNaOH；2mol/LNaOH；2mol/L

HCl；0.001MHCl；硫酸铵；氯化钙。0.8mol/LpH9.0硼酸缓冲液：取20ml0.8

mol/L硼酸溶液，加80ml0.2mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。

0.4mol/LpH9.0硼酸缓冲液（用0.8mol/L稀释1倍即可）；0.2mol/LpH8.0

硼酸缓冲液：取70ml0.2mol/L硼酸溶液，加30ml0.5mol/L四硼酸钠溶液，

混合后，用pH计校正。0.05mol/LpH8.0Tris－HCl缓冲液：取50mL0.1

mol/LTris加29.2mLmol/LHCl加水定容至100mL。

底物溶液的配制：即每毫升0.05mol/LpH8.0Tris－HCl缓冲液中加0.34毫克

BAEE和2.22毫克的氯化钙。

二、材料

新鲜或冰冻猪胰脏

三、仪器

食品加工机和高速分散器；研钵；大玻璃漏斗；布氏漏斗；抽滤瓶；纱布；恒温

水浴；紫外分光光度计；秒表；pH试纸。

操作方法

一、猪胰蛋白酶制备

（一）猪胰蛋白酶原的提取

猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，加入2倍体

积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于