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一、生命大分子制备

1、生物大分子的特性：

（1）由结构比较简朴的小分子所组成

（2）具有非常复杂的结构

2、生物大分子制备难度：

（1）生物材料的组成极其复杂

（2）许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的环节繁多，流程又长

（3）许多生物大分子极易失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件

（4）溶液的温度、PH值、离子强度等各种参数综合影响溶液中生物大分子的制备，很难准确估计和判断，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。

3、生物大分子制备的通常环节：

（1）拟定要制备的生物大分子的目的和规定

（2）建立相应的可靠的分析测定方法

（3）通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子的物理化学性质

（4）生物材料的破碎和预解决

（5）分离纯化方案的选择和探索

（6）生物大分子制备物的纯度的鉴定。规定达成一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰

（7）产物的浓缩，干燥和保存

4、蛋白质的分离纯化：

（1）材料获得：天然获得；基因工程手段获得

（2）粗分离：除去大量杂质和杂蛋白，初步浓缩目的蛋白

（3）细分离：常压柱层析：分子筛层析、离子互换层析、疏水层析、亲和层析

（4）鉴定：纯度、浓度、活性

5、蛋白质的结构研究：

（1）一级结构：氨基酸组成分析、末端分析、肽谱分析

（2）二级结构：紫外光谱法、荧光光谱法、园二色性法、红外光谱法、激光拉曼光谱法

（3）高级结构：X-射线衍射法、核磁共振法

（4）结构与功能的关系：突变、晶体分析、蛋白与蛋白的互相作用

6、酶活力：酶催化一定化学反映的能力。

7、酶活力单位：每分钟催化生成一微摩尔产生所需要的酶量为一个酶活力单位。

8、制备生物大分子的方法：

（1）以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等

（2）以溶解度的差异为依据的方法：盐析。萃取、分派层析、选择性沉淀和结晶等

（3）以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子互换层析等

（4）以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等

9、酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位娄，是酶制剂纯度的一个指标

10、回收率：纯化过程中酶活性的收率

11、纯化位数：指提纯后与提纯前酶比活力的比值

增大纯化位数和缓慢减少回收率的方法属于有应用价值的方法。

12、蛋白质的鉴定：

（1）浓度：紫外法、Lowry法、Bradford法、凯氏定氮法、双缩脲法

（2）纯度：电泳法、化学法、仪器法

（3）分子量测定：SDS、凝胶过滤、氨基酸组成分析、毛细管电泳

（4）等电点：等电聚焦电泳

（5）活性：激酶、磷酸化酶、运用靶酶活性、氧化还原酶、ELISA。

二、沉淀法

1、沉淀法：

纯化大分子物质的一种经典方法。

操作简朴，成本低廉。不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。

沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程，可以有选择性的沉淀杂质或有效成分。

原理：不同物质在溶剂中的溶解度不同而达成分离的目的(又称溶解度法)

改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中各种物质的溶解度发生变化。选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或者相反，有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大溶解度。然后通过适当解决，即可达成从抽提液中分离有效成分的目的。

2、沉淀可以分为可逆性沉淀和不可逆性沉淀

可逆性沉淀：在沉淀过程中，有效成分结构和性质都没发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液。可逆沉淀是分离和纯化有效成分的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法。

不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，并且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀物不也许再重新溶解于水溶液。加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物碱沉淀。（沉淀物一般是杂质）

3、常用的沉淀方法和沉淀剂：

（1）盐析法：选用中性盐为沉淀剂，多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。

（2）有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子，多糖及核酸类产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。

（3）等电点沉淀法：用于氨基酸，蛋白质及其他两性物质的沉淀，但单独应用较少，多与其他方法结合使用。

4、制备蛋白质：

（1）盐析法：

在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。

1-1．优点：①成本低，不需要特别昂贵的设备。

②操作简朴、安全。

③对许多生物活性物质具有稳定作用。

在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增长，称为“盐溶”现象。

但中性盐的浓度增长至一定期，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。

由于中性盐的亲水