人体粪便样本中溶藻弧菌检测.pdf

人体粪便样本中溶藻弧菌检测

1范围

本文件描述了人体粪便样本中溶藻弧菌的检测方法。

本文件适用于人体粪便样本中溶藻弧菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文

件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4设备和材料

4.1恒温培养箱：36℃±1℃。

4.2恒温水浴箱：50℃±1℃。

4.3全自动微生物生化鉴定系统。

4.4实时荧光PCR仪。

4.5基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪：微生物指纹图谱数据库中应包括溶藻弧菌等常见致病性弧菌。

4.6低温高速离心机：转速≥12000r/min。

4.7恒温水浴锅或金属浴：可控温100℃。

4.8微量移液器及带滤芯吸头：0.1μL～2μL、2μL～10μL、10μL～20μL、20μL～200μL、

100μL～1000μL。

4.9无核酸酶PCR管、离心管。

4.10无菌接种环：10μL、1μL。

4.11无菌培养皿：直径90mm。

4.12无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm。

4.13无菌锥形瓶：容量500mL、1000mL。

4.14漩涡混匀器。

4.15一次性或重复使用靶板。

4.16显微镜。

5培养基和试剂

实验用水应符合GB/T6682三级水的要求

1

5.1Cary-Blair运送培养基：符合附录A中A.1的规定。

5.23%氯化钠碱性蛋白胨水：符合附录A中A.2的规定。

5.3硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：符合附录A中A.3的规定。

5.4弧菌显色培养基。

5.53%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：符合附录A中A.4的规定。

5.6革兰氏染色液：符合附录A中A.5的规定。

5.7氧化酶试剂：符合附录A中A.6的规定。

5.83%氯化钠三糖铁琼脂：符合附录A中A.7的规定。

5.9嗜盐性试验培养基：符合附录A中A.8的规定。

5.103％氯化钠甘露醇试验培养基：符合附录A中A.9的规定。

5.113％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：符合附录A中A.10的规定。

5.123％氯化钠Voges-Proskauer（V-P）培养基：符合附录A中A.11的规定。

5.13V-P试剂：符合附录A中A.12的规定。

5.14ONPG试剂：符合附录A中A.13的规定。

5.15生化鉴定试剂盒。

5.16细菌DNA提取试剂盒。

5.17荧光PCR反应配套试剂：2×PremixExTaqTM、灭菌去离子水、引物、探针，或商品化溶藻弧菌

荧光PCR检测试剂盒。

5.18α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质溶液：符合附录A中A.14的规定。

6操作步骤

6.1样本的收集

采集新鲜粪便样本2个黄豆至蚕豆大小,水样便采集大约2mL～5mL。所采集的粪便样本2h内

运送到检测实验室，若运送时间超过2h，样本应放入Cary-Blair运送培养基中；肛拭子样本应放入

Cary-Blair运送培养基中24h内运送至实验室。

6.2增菌

从样本盒中挑取黄豆粒大小粪便样本(水样便大约取300μL～500μL),加入到10mL的3%氯化

钠碱性蛋白胨水中，充分混匀，36℃±1℃增菌培养8h～18h；肛拭子从运送培养基中取出，直接

放入10mL的3%氯化钠碱性蛋白胨水中，充分震荡，36℃±1℃增菌培养8h～18h。

6.3分离

取增菌液划线接种于TCBS琼脂和弧菌显色培养基，于36℃±1℃培养18h～24h。典型的溶

藻弧菌菌落在TCBS琼脂上呈圆形、表面光滑、大而扁平的黄色菌落，直径2mm～3mm。在弧菌显色

培养基上的菌落特征参照产品说明书进行判定。

6.4纯培养

在TCBS琼