酶工程酶分子定向进化.ppt

噬菌体显示的几种类型第63页,共73页，星期六，2024年，5月M13噬菌体pIII和pVIII的显示第64页,共73页，星期六，2024年，5月核糖体显示技术第65页,共73页，星期六，2024年，5月RNA-蛋白质融合技术第66页,共73页，星期六，2024年，5月RNA-蛋白质的融合第67页,共73页，星期六，2024年，5月寡霉素与核苷酸的连接第68页,共73页，星期六，2024年，5月Mycds-DNA的富集第69页,共73页，星期六，2024年，5月交错延伸PCR突变法第70页,共73页，星期六，2024年，5月质粒肽库的设计和筛选（引自Schatz等，1996）第71页,共73页，星期六，2024年，5月抗体库的构建和筛选第72页,共73页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第73页,共73页，星期六，2024年，5月**自然突变需要经历一个漫长的过程，突变后的性状，按照“适者生存、不适者淘汰”的自然筛选法则也需要几万年、几百万年甚至更长的筛选过程。在某种意义上来说，进化是一门难以用实验重演或最终证明的科学****广谱金属蛋白酶—嗜热菌蛋白酶（TLP-ste)，8-fold突变体100?C（●）；TLP-ste80?C(▲)和90?(+);嗜热菌蛋白酶90?C(A)**红色表示突变位点**********Figure2.Sequenceanalysisof10randomly-pickedclonesfrom(unscreened)B.subtilissubtilisinERPRlibrary.Eachlinerepresents986-bpsubtilisinEgeneincludingthe45bpprosequence,theentirematuresequenceand113bpafterthestopcodon.Triangles([nabla])indicatepositionsofnewpointmutationsintroducedduringRPR.Box([squf])inC6indicatestheshortstretchcontainingfourmutationsbetweentworepeats(5-CGGTACG-3).Positionsandfrequencyofmutationsinthe10clonesareindicated**Figure2.DiagramofDNAshuffling.First,theparentalsequencesarerandomlyfragmentedbytheenzymeDNaseI.ThefragmentsarethenreassembledbyrepeatedprimerlessPCRcycles.Eachcycleconsistsof(i)denaturization,whendoublestrandsofDNAareseparatedintosinglestrands,(ii)annealing,whenDNAfragmentsreannealformingduplexesand(iii)extension,whentheadditionofnewnucleotidesiscatalyzedbyapolymeraseenzyme.Crossoversaregeneratedduringtheextensionstepwhenduplexescomposedoffragmentsfromdifferentparentshavenewnucleotidesadded.Aftermanycycles,full-lengthsequencesarereassembled.

**Figure1.Resultsofsequencinggenesfrom10randomly-selectedunscreenedclonesfromDNAshuffledlibrary.Linesrepresent986bpofsubtilisinEgeneincluding45ntofitsprosequence,theentirematureseque