共聚焦激光扫描显微术课件.pptVIP

;一、概述;简史:

马文.闵斯基(MarvinMinsky)1957

〔美国专利〕

矛盾：成像质量、扫描速度

狭缝扫描:成像质量不佳

台阶扫描:光栏不动，移开工作台标本

光束扫描：现通用;二、根本原理;2.成像保存

以电信号形式储存，

可以进行图象分析〔参数、伪彩、值等〕。

3.共轭(confocal)

是指光源孔和检测针孔对物镜焦平面是共轭的。;宽场照明显微镜和共聚焦图象比较;三、CLSM的应用;;;图象处理功能

1.光学切片功能：显微CT

微动进步马达最小步距0.1um

2.三维图象重建：3D软件

X，Y，Z轴重建，立体旋转

;3.荧光物质的定位，定量与动态测量〔单标、双标、多重标记〕

;;;;高速采集;FRAP光漂白;Tubulin;Actin;;

;;;;FRAP荧光粹灭漂白恢复法举例;A;A;4、膜流动性的测定

细胞膜荧光探针受到极化光的刺激激化后，

发射光的极性依赖于荧光分子的旋转，

而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围膜流动性，

故极性测量可以反映膜的流动性;;笼锁化合物的两种光化学反响原理：

偶氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光致分解作用;;2.邻硝基甲苯衍生物：

目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯的光敏性质合成。

当生物活性分子与硝基甲苯结合即暂时失活，故又将后者称为掩蔽基团或笼锁基团。

一旦受到光照，连接于侧链碳原子的前体即解离而释放出活性分子、质子和亚硝基副产物。;笼锁神经递质、调质及抗体

例：光照解笼锁

NPE-氨甲酰胆碱→血管平滑肌收缩〔氨甲酰释放〕

Caged入Cell途径：诱入法，酯化法，电极导入法，膜片钳全细胞方式导入法;CLSM的优点;四、CLSM使用步骤;〔二〕??选择荧光探针

1000余种

钙：Fluo-3/am(水溶性)不用紫外光激发，可渗透细胞。Fluo-2用紫外激发，不穿透，需用Microinjection

观察细胞内PH：Snarf荧光素中插入萘而合成，可与Fluo-3或Fluo-2联合测定细胞内钙与PH;CLSM常用荧光探针;;;Livingdye-GreenFluorescenceprotein(GFP);绿色荧光蛋白GFP分子结构图;当GFP受紫外光或蓝光激发时，α-螺旋包含的发色团会发出绿色荧光。

由于这一特点及其无种属限制，GFP作为荧光标签被广泛用于细胞水平上的监测生物活动??;在GFP基因上突变几个不同的位点形成增强型绿色荧光蛋白(enhancedGFP,EGFP),黄色〔EYFP〕,黄绿色〔ECFP〕和兰色〔EBFP〕的活体荧光蛋白。

这些荧光蛋白都具有稳定、无细胞毒性、灵敏度高,不需反响基质〔substrate〕等优点,又称为单标记系统〔singletagsystem〕。;TheDiscoveryofAequorinandGFP;;;转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内有少量GFP阳性细胞。

(荧光+普通光相差显微镜×100倍);加血清48h后，神经干细胞集落内和周边均有GFP阳性细胞。

(荧光＋普通光相差显微镜，荧光相差显微镜×400倍);;;;最重要是能用于活细胞和蛋白质进行实时定位和观察，不需特殊的激发光谱，故又将此组荧光蛋白称为自动荧光蛋白(autofluorescentproteins,AFPs)。

红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacificseaanemonerelativeDiscomaStriiata中别离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名为DsRed。;1.神经细胞参数测定及三维重建

细胞外形

浦肯野氏细胞及其突起的投射

神经细胞轴突走向及神经支配的研究

神经骨架重组的研究;2.神经递质、调质及细胞内活性物质受体的荧光定位

3.细胞内钙离子的测定

细胞内信号传导的研究

钙内流与神经递质释放的关系

微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释放

4.细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细胞内PH变化;;划痕负载法计算公式;;Thanksforyourattention!