生物技术《基因工程实验》讲义.doc

《生物技术系列实验》

基因工程实验教案

福建师范大学福清分校生物与化学工程系董倩

表1基因工程实验教案规划

实验工程名称

实验内容

学时

实验

类别

实验

要求

实验

类型

每组

人数

一目的基因的特异PCR扩增及产物检测

11

〔1〕实验室介绍、实验原理

〔2〕目的基因的特异引物设计

〔3〕目的基因的特异引物合成*

〔4〕PCR扩增目的基因

〔5〕PCR产物的凝胶电泳检测

8

专业

实验

必做

设计

综合

10

二转化与重组子的筛选12

〔1〕实验原理及实验设计

〔2〕培养基、药品的配制

〔3〕感受态细胞与重组子的制备*

〔4〕转化感受态细胞

〔5〕蓝白斑筛选重组子

〔6〕阳性重组子的鉴定*

8

专业

实验

必做

设计

综合

10

三SDS法检测目的蛋白的表达

〔1〕实验原理及实验设计

〔2〕培养基、药品的配制

〔3〕目的基因的诱导表达*

〔4〕表达蛋白的提取*

〔5〕SDS检测及分析

8

专业

实验

选做

设计

综合

10

四利用基因枪法制备转基因植物13

〔1〕基因枪的工作原理和操作方法

〔2〕植物再生体系的建立*

〔3〕利用基因枪制备转基因植物

〔4〕转基因检测

8

专业

实验

必做

讲授与示范

10

*为可选项。其它为必修。

实验一、目的基因的特异PCR扩增及产物检测

实验目的及要求

掌握PCR法体外扩增DNA的根本原理和特异PCR引物及参数的设计；

掌握PCR技术和核酸琼脂糖凝胶电泳技术的常规操作；

利用PCR技术获得目的基因。

实验内容

根据模板DNA，设计并合成特异引物〔合成引物可由生物公司完成〕，设定PCR参数，通过PCR技术扩增目的基因，并利用琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR产物。

实验室考前须知：

配制基因工程各种试剂，必须要使用重蒸水。配制药品取试剂时，所用的钥匙不能混用，否那么会造成药品污染。

但凡可以进行灭菌的试剂与用具都必须要经过高压蒸汽灭菌后进行使用，防止其它杂质或酶对DNA、RNA或蛋白质的降解。

对于Eppendorf管、吸嘴〔tip〕与非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50℃温箱中烘干使用。每次tip用毕应更换，不要相互污染试剂。

限制性内切酶等工具酶保存于50％的甘油中，-20℃可以长期保存。应自始至终将酶保持在零度以下，取酶时不能用手指接触储存酶的局部。在需要加酶的时候将酶从冰箱中取出，放在冰盒里，用完后立即放回冰箱。防止反复冻溶。

微量移液器的使用：微量移液器是连续可调的、计量和转移液体的专用仪器。使用前应了解其容量范围及读数方法。按钮向下压以及放的动作、速度要缓慢平稳。

离心机的使用：使用前应先熟悉或学习其使用方法，应注意保持离心管放置位置的对称以及离心管中样品的平衡，并要拧紧盖好其中的离心机内部的盖子，否那么会损坏仪器。此外应注意离心管在离心机内的放置方向。

电子天平使用：使用前应先熟悉或学习其使用方法，注意天平的最大称量范围，放置位置无振动、空气无对流，水平泡调节至中央位置，使用后应保持仪器的洁净。

实验过程中应做好每个样品的标记工作，如样品的名称、保存的时间．且一般在Eeppendorf管上用记号笔作标记时，应在两处重复做好标记。

必须穿实验服，禁止吃食物，认真完成预习报告及实验报告，使用贵重精密仪器时要登记记录，每天安排3人值日。

撰写试验报告：封面〔试验课程、题目、组别、作者、交出日期等〕――目录――摘要――前言――材料与方法――结果――讨论――参考文献――图表。

补充：

oo

××

图1离心机的平衡

图2微量移液器的构造

操作：

1)取吸嘴：未装吸嘴的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体，取吸嘴时不要敲击使之套紧，以免造成微量移液器内部构件松动导致吸液不精确。一定要在允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否那么会造成损坏。不要用大量程的移液器移取小体积样品。

2)将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；

3)垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液面下几毫米，千万别将吸嘴直接插到液体底部;

4)缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上液体。否那么液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少;

5)等一秒钟后将吸嘴提离液面；

6)平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体，提起微量移液器，使吸嘴在容器壁擦过；

7)然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。不要横放带有剩余液体吸嘴的移液器。

稳固与练习：

精确称量0.005g、0.05g、0.5g、5g的NaCl。

使用微量移液器分别量取1mL、200μL、100μL、20μL、10.5μL、2μL的水。

将低温离心机设定参数为：4℃－5000rpm－2min－10mL；5℃－10000rpm－2min－1.5mL；

将PCR仪设定参数为：hotsta