中国农业大学《基因工程》.pdf

基因工程：是在分子水平上进行的操作，指将多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合

成基因，按照人们的愿望，严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）细胞中，使之

能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。三要素：供体受体载体。

基因工程的主要内容：1.目的基因的获取2.重组体的制备3.重组体的转化4、克隆鉴定5、目的基因的表

达

限制性内切酶：是一种能够识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列（4-8bp）并由此处切割双链的核酸

内切酶。1、来源：原核生物2、性质：在核酸分子链的内部制造切口3、功能：自身保护作用（R/M

体系：保护自身的DNA不受限制，破坏外源的DNA使之迅速讲解）

影响限制酶活性的主要因素：1、DNA的纯度2、DNA的甲基化程度3、温度4、缓冲溶液5、DNA的

分子结构

Klenow片段：E.coliDNA聚合酶Ⅰ经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残

基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外

切酶活性。功能：1、3ˊ断的补平；2、DNA3ˊ末端标记；3、cDNA第二链的合成。

平齐末端DNA的连接方法：1、同聚物加尾法2、衔接物法；3、接头连接发。

双酶切相对单酶切的优点：可保证插入外源片段的方向，防止载体自连，提高重组率。

星号活性：在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。

部分酶切：指选用的核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。

发生部分酶切的原因：底物DNA纯度低；识别序列甲基化；酶用量不足；反应缓冲液和温度不适宜。

碱性磷酸酶和S1磷酸酶的功能：碱性磷酸酶主要是脱磷酸作用，其产物具有5-OH末端，这种功能使它在

DNA分子克隆实验中发挥着重要作用，利用该酶可以有效防止粘性末端分子自连。

S1核酸酶：是一种高度单链特异的核酸内切酶，可降解单链DNA或RNA，不仅能催化RNA和单链DNA

分子降解成为5单核苷酸，而且它也能作用于双链核苷酸单链区。功能：测定杂种核酸分子的杂交程度，

给RNA分子定位，测定真核生物基因中间隔子序列的位置，探测双螺旋的DNA区域，从限制性内切酶

产生的粘性末端中移去单位链突出序列以及打开双链cDNA合成期间形成的发夹结构。

载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。

基因工程对载体的要求：1、在宿主细胞能独立复制2、有选择性标记3、有一段多克隆位点4、分子量

小、拷贝数多5、容易从宿主细胞中分离纯化

质粒载体必须具备的条件：1、具有复制起点2、具有抗菌素抗性基因3、若干限制酶的单一位点4、具

有较小的分子量和较高的拷贝数

质粒的分离：通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌的裂解。1、氯化铯密度梯度离心

法2、碱变性法3、微量碱变性法

质粒载体的基本构型：1、共价闭合环状DNA2、开环DNA3、线性DNA

表达型质粒载体：主要使外源基因表达出蛋白质产物，如果在大肠杆菌里表达，必须使所克隆的真核生物

的基因置于大肠杆菌的转录和翻译之下。

穿梭质粒载体：人工构建的具有两种不同重复起点和选择标记，可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制

的质粒载体。

大肠杆菌表达载体的操纵元件：阻遏基因I，操纵基因O，启动基因P，核糖体结合位序列，转录终止信

号。

质粒载体不稳定的因素：1、结构的不稳定性：DNA的插入，缺失和重排都会造成质粒载体结构不稳定。

2、分离的不稳定:在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的

优势群体。

影响质粒载体稳定性的主要因素：1、新陈代谢负荷a、复制负荷b、转录和翻译负荷2、质粒载体的拷

贝数3、寄主菌的重组体系

PCR的原理和特点：原理：类似于DNA的体内复制，首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应

混合冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高，使退火引物在DNA

聚合酶作用下得以延伸，这种变性、复性、延伸的过程，就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下

的这种循环的不断重复。特点：