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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(10)申请公布号CN102321720A
(43)申请公布日2012.01.18
(21)申请号CN201110214513.9
(22)申请日2011.07.28
(71)申请人万晓春
地址广东省深圳市南山区西丽深圳大学城学苑大道1086号
(72)发明人万晓春姚红吴洪飞
(74)专利代理机构北京国林贸知识产权代理有限公司
代理人李桂玲
(51)Int.CI
C12P21/08
C12N5/20
权利要求说明书说明书幅图
(54)发明名称
一种混合细胞培养生产纯人源单克
隆抗体的方法
(57)摘要
本发明一种混合细胞培养生产纯人
源单克隆抗体的方法，该方法将T细胞、
B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培
养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促
进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异
性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单
克隆抗体。本发明采用的技术为混合细胞
培养法，简单易行，操作方便，一步到
位，筛选过程简单，节省大量人力物力；
单抗生产效率大大提高，融合细胞产生抗
体的比例成倍增加；本发明的大多数的克
隆成功的实现了从IgM到IgG的类型转
化，生产IgG型单抗几率大大提高。
法律状态
法律状态公告日法律状态信息法律状态
权利要求说明书
1.一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于：该方法将T细胞、
B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促
进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源
单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于：
所述的纯人源单克隆抗体为乙肝抗体。
3.根据权利要求1或2所述的生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于：该方法
包括以下阶段：
A、第一阶段：细胞体外混合培养及刺激：
a.筛选注射过乙肝疫苗的健康自愿献血者，采集对乙肝疫苗呈免疫阳性反应的健康
自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体CD-4T细胞；
b.将所述的人体CD-4T细胞用乙肝疫苗抗原短肽进行激活反应，得到激活的人体
CD-4T细胞；
c.对与A-a步骤中同一乙肝疫苗免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分
离提纯处理，得到人体B细胞；
d.对离体的人体淋巴结样品进行分离提纯处理，得到人体淋巴结内皮细胞；
e.将所述的激活的人体CD-4T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞稀释为混
合细胞悬液，进行混合培养，并在培养过程中加入抗原进行刺激，得到成熟、增殖
的细胞；
B、第二阶段：细胞融合：
将所述的成熟、增殖的细胞与人用杂交骨髓瘤细胞进行融合处理，得到融合杂交瘤
细胞；所述的融合处理采用聚乙二醇诱导；
C、第三阶段：单克隆化：
将上述扩增的杂交瘤细胞进行单克隆化，得到单克隆细胞株；所述的单克隆化的方
法为限制性梯度稀释；
D、第四阶段：阳性克隆验证：
在所述的单克隆细胞株于37℃进行细胞培养2-3周后，此时选取培养盘的细胞孔
中的上清液进行酶联免疫吸附法筛选，检测培养液中IgG及IgM浓度；选择
IgG浓度高的细胞孔，进行特异性筛选，得到阳性结果的即为抗原特异性的单克隆
细胞株；
E、第五阶段：单克隆抗体生产：
将所述的抗原特异性的单克隆细胞株再进行扩增后，进行大规模单克隆抗体的生产，
再进行单克隆抗体的分离提纯处理，得到所述的纯人源单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于：
步骤A-e所述的刺激的方法为：
将所述的混合细胞悬液加入到细胞培养盘内，再加入最终浓度为50-1000ng/
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