一种香港海鸥型菌快速检测试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN1858250A

(43)申请公布日2006.11.08

(21)申请号CN200610034313.4

(22)申请日2006.03.15

(71)申请人中国水产科学研究院南海水产研究所

地址510300广东省广州市新港西路231号

(72)发明人杨贤庆李来好岑剑伟郝淑贤刁石强吴燕燕石红周婉君陈胜军

(74)专利代理机构广州知友专利商标代理有限公司

代理人宣国华

(51)Int.CI

C12Q1/68

C12Q1/04

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

一种香港海鸥型菌快速检测试剂盒

及检测方法

(57)摘要

本发明提供一种香港海鸥型菌快速

检测试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测

方法是以香港海鸥型16sRNA保守片段序

列设计的一对引物为主体而设计的。本发

明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，反应产

物在琼脂糖电泳上显示特异的谱带。对淡

水鱼肠道中的香港海鸥型菌的特异性DNA

片断进行定性检测，简便快速，特异性

好，灵敏度高；可用于可致人严重肠胃炎

的病原菌—香港海鸥型菌的检测，对提高

我省淡水产品食用安全性有很大的社会经

济效益，具有很高的实用价值。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

利要求说明书

a.裂解液1瓶，内含8-12mmol/LTris-HCl，1-3mmol/LEDTA，0.1％-0.5％SDS，

pH7.5-pH8.5；

b.醋酸钾溶液1瓶，内含2-3mol/L醋酸钾溶液；

c.TE缓冲液1瓶，内含50mMEDTA，0.1-0.5mol/LpH7.0的Tris-HCl缓冲液；

d.PCR反应液1管，内含8-15％蔗糖、0.1-0.3mM甲酚红、1-3unitTaq酶、100-

dNTP、含Mgsup2+/sup的10×缓冲液、0.2μM上下游引物，

上游引物序列为GAGTGGCGAACGGGTGAGTA

下游引物序列为TGTCTCCCAGCGATTCGGCG；

e.阳性对照液1管，内含较高浓度的香港海鸥菌总DNA；

f.盒子。

2根据权利要求1所述的香港海鸥型菌快速检测试剂盒，其特征在于：所述的含

Mgsup2+/sup的10×缓冲液包含2-3mMKCL、0.1-1mMTris-HCl、0.1-

0.5mMMgClsub2/sub。

3一种香港海鸥型菌快速检测方法，其特征在于使用权利要求1的试剂盒，按以下

步骤进行：

a.样品的预处理：取样品适量，按料水比1∶4加入无菌水，充分振荡悬浮，离心，

弃去上清夜；

b.在沉淀物中加入0.5-1ml裂解液，充分悬浮沉淀，精确沸水浴2-5min；

c.加入200μl醋酸钾溶液漩涡振荡，冰浴2min，12000r/min离心5-10min；

d.上清液转移至载有500μl异丙醇的离心管，振荡充分混合，以12000r/min的速度

离心3-5min，弃去上清液；

e.加入0.5ml70％乙醇，振荡30s，12000r/min离心3-5min，吸去上清液，室温干

燥5min，加入20-50μlTE缓冲液漩涡振荡，得样品PCR模板；

f.PCR反应

将PCR反应液加入到中反应管，再分别取样品模板和阳性对照液，将已加样的反

应管置于PCR仪上；

g.按下列条件进行扩增

94℃3-5min预变性→94℃变性30-50s→57℃复性50s→72℃延伸1min→(第二步至

第四步25-35个循环)→72℃延伸5-10min→4℃保存；

h.反应结束后取上述PCR产物5-10μl直接点样于浓度为1-1.5％琼脂糖凝胶