《病毒转基因技术原理腺相关病毒》ppt教案模板.pptx

;第一节 腺相关病毒简介;第一部分生物学特性;血清型;转导不同组织器官的AAV最优血清型;病毒结构;ITR

?ITR中的前125个核苷酸具有回文结构，其中还存在两个小的内部回文结构，可自身折叠后经碱基配对、形成T字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸，保持非配对状态，称为D序列（Dsequence）。

?ITR中还具有Rep结合元件（Repbindingelements，RBEs)RBE和RBEˊ，以及一个末端解离位点TRS

（terminalresolutionsite）等重要序列。

?ITR是在AAV生物学中重要的顺式

（cis）作用活性元件，在病毒复制中

具有重要作用：在非容许条件下，ITR在病毒复制的负调控中起关键作用；在容许条件下，作为病毒基因组复制的起点和引物。

?ITR对病毒基因组的包装、转录、以及位点特异性的整合，均是必需的。;左端的ORF（Rep基因）;右端的ORF（Cap基因）;病毒复制;不同血清型的AAV感染的细胞类型不同，这取决于不同血清型的AAV靶向细胞表面的受体的差异。而且这也决定了不同血清型的病毒在细胞内的不同的运输途径;AAV病毒基因组的复制模型左为RFm，右为RFd）;AAV的复制周期可以分为两个阶段;?染色体q13.4的AAVS1位点中最少33bp的序列，包含由8个核苷酸分开的RBE样和TRS样序列，对AAV的靶向整合是必须而且充分的条件。位点特异性的整合过程即使是在Rep78和Rep68蛋白理想表达的条件下，未必是完全是位点特异的，大约40-70%的整合发生在AAVS1位点;?AdV能提供辅助功能的基因有

E1a，E1b55K，E2a，E4orf6和

VARNA（viralassociatedRNA）。

HSV-1能提供辅助AAV复制功能，至少涉及HSV-1的复制蛋白，包括helicase/primasecomplex(UL5,UL8,和UL52)和DNA结合蛋白ICP8（UL29）。;对环境理化因素的抵抗力;第二部分致病性与免疫性;?蛋白表达型腺相关病毒载体

―三成分包装系统

―自我互补型AAV载体（self-complementaryAAVvector，scAAV）

―反式剪接型AAV载体（trans-splicingAAVvector,tsAAV）

―衣壳蛋白修饰型AAV载体

?基因打靶型腺相关病毒载体

?rAAV的纯化和定量;第一部分蛋白表达型腺相关病毒载体;?三成分包装系统:

rAAV转移载体仅保留野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合必须的顺式作用元件——基因组两端的ITR序列；全部去掉rep??cap基因及其控制序列，用外源基因及其控制序列代替。实际包装外源基因的上限仅为4.4kb。

rAAV辅助质粒是克隆的ITR缺失的野生型AAV的基因组，以反式方式提供rep和cap基因编码蛋白的功能。目的在于病毒包装过程中，避免野生型AAV病毒的形成。

AdV辅助病毒质粒，包括其起辅助功能的基因E2a，E4orf6和VARNA。

E1a和E1b55K可由HEK293细胞提供。;?三成分包装系统优点:

―快速、有效，

―避免了辅助病毒的使用

?三成分包装系统不足:

―当rAAV用于心脏、肝脏和骨骼肌等器官时，制备大量的rAAV耗时、耗力

―采用大规模悬浮细胞培养技术可克服这一障碍，并研制了三种替代的方法;?三成分包装系统的大规模悬浮细胞培养技术:;策略2constructedAdhelperplasmidsthatarecotransfectedontoE1a/E1b-expressing293cellsalongwithaplasmidthatexpressestherepandcapgenesandavectorplasmid;?自我互补型AAV载体（self-complementaryAAVvector，scAAV）

―重组AAV（ssAAV）进入细胞后，在启动蛋白表达之前，重要的限速步骤是单链基因组需要转换成为双链基因组。

―McCarty等缺失了rAAV的一个ITR区的TRS（△trs），阻止其突变末端参与复制的启动，最终形成一个呈现串联的、单链的反向重复的基因组，其两端是野生型的ITR，但中间一个是突变型的ITR。

―脱出衣壳后，将以中间突变的ITR为基础折叠形成发夹结构，形成自我互补的双链，因此，在组织或体外实验中可以快速和高效表达。

―这种类型的scAAV的包装能力仅为ssAAV的一半，大约2.3kb。

―最近的进展是利用scAAV表达小干扰RNA(siRNA，small-interferenceRNA)。;?自我