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;第一节 腺相关病毒简介;第一部分生物学特性;血清型;转导不同组织器官的AAV最优血清型;病毒结构;ITR
?ITR中的前125个核苷酸具有回文结构,其中还存在两个小的内部回文结构,可自身折叠后经碱基配对、形成T字形的发夹结构;剩余的20个核苷酸,保持非配对状态,称为D序列(Dsequence)。
?ITR中还具有Rep结合元件(Repbindingelements,RBEs)RBE和RBEˊ,以及一个末端解离位点TRS
(terminalresolutionsite)等重要序列。
?ITR是在AAV生物学中重要的顺式
(cis)作用活性元件,在病毒复制中
具有重要作用:在非容许条件下,ITR在病毒复制的负调控中起关键作用;在容许条件下,作为病毒基因组复制的起点和引物。
?ITR对病毒基因组的包装、转录、以及位点特异性的整合,均是必需的。;左端的ORF(Rep基因);右端的ORF(Cap基因);病毒复制;不同血清型的AAV感染的细胞类型不同,这取决于不同血清型的AAV靶向细胞表面的受体的差异。而且这也决定了不同血清型的病毒在细胞内的不同的运输途径;AAV病毒基因组的复制模型左为RFm,右为RFd);AAV的复制周期可以分为两个阶段;?染色体q13.4的AAVS1位点中最少33bp的序列,包含由8个核苷酸分开的RBE样和TRS样序列,对AAV的靶向整合是必须而且充分的条件。位点特异性的整合过程即使是在Rep78和Rep68蛋白理想表达的条件下,未必是完全是位点特异的,大约40-70%的整合发生在AAVS1位点;?AdV能提供辅助功能的基因有
E1a,E1b55K,E2a,E4orf6和
VARNA(viralassociatedRNA)。
HSV-1能提供辅助AAV复制功能,至少涉及HSV-1的复制蛋白,包括helicase/primasecomplex(UL5,UL8,和UL52)和DNA结合蛋白ICP8(UL29)。;对环境理化因素的抵抗力;第二部分致病性与免疫性;?蛋白表达型腺相关病毒载体
―三成分包装系统
―自我互补型AAV载体(self-complementaryAAVvector,scAAV)
―反式剪接型AAV载体(trans-splicingAAVvector,tsAAV)
―衣壳蛋白修饰型AAV载体
?基因打靶型腺相关病毒载体
?rAAV的纯化和定量;第一部分蛋白表达型腺相关病毒载体;?三成分包装系统:
rAAV转移载体仅保留野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合必须的顺式作用元件——基因组两端的ITR序列;全部去掉rep??cap基因及其控制序列,用外源基因及其控制序列代替。实际包装外源基因的上限仅为4.4kb。
rAAV辅助质粒是克隆的ITR缺失的野生型AAV的基因组,以反式方式提供rep和cap基因编码蛋白的功能。目的在于病毒包装过程中,避免野生型AAV病毒的形成。
AdV辅助病毒质粒,包括其起辅助功能的基因E2a,E4orf6和VARNA。
E1a和E1b55K可由HEK293细胞提供。;?三成分包装系统优点:
―快速、有效,
―避免了辅助病毒的使用
?三成分包装系统不足:
―当rAAV用于心脏、肝脏和骨骼肌等器官时,制备大量的rAAV耗时、耗力
―采用大规模悬浮细胞培养技术可克服这一障碍,并研制了三种替代的方法;?三成分包装系统的大规模悬浮细胞培养技术:;策略2constructedAdhelperplasmidsthatarecotransfectedontoE1a/E1b-expressing293cellsalongwithaplasmidthatexpressestherepandcapgenesandavectorplasmid;?自我互补型AAV载体(self-complementaryAAVvector,scAAV)
―重组AAV(ssAAV)进入细胞后,在启动蛋白表达之前,重要的限速步骤是单链基因组需要转换成为双链基因组。
―McCarty等缺失了rAAV的一个ITR区的TRS(△trs),阻止其突变末端参与复制的启动,最终形成一个呈现串联的、单链的反向重复的基因组,其两端是野生型的ITR,但中间一个是突变型的ITR。
―脱出衣壳后,将以中间突变的ITR为基础折叠形成发夹结构,形成自我互补的双链,因此,在组织或体外实验中可以快速和高效表达。
―这种类型的scAAV的包装能力仅为ssAAV的一半,大约2.3kb。
―最近的进展是利用scAAV表达小干扰RNA(siRNA,small-interferenceRNA)。;?自我
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