- 1、本文档共26页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
DNA提取方法和试剂作用
加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.(2).阴离子去污剂法;用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA
(3).苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态
(4).水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%,80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.
1.动物来源的DNA的提取
1.1经典提取方法
酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最为经典的方法,目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的,这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞。在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质,再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高浓度的甲酞胺解聚蛋白质与DNA的结合,然后利用透析来处理DNA样品。这些经典方法获得的DNA纯度很高,能够满足各种试验的要求,但操作繁琐,用时长,且所用试剂具有一定的毒性。
1.2玻璃棒缠绕法
该法用盐酸肌裂解细胞,然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上,用一个带钩的或前端为U形的玻璃棒在这两层液体的交界面慢慢搅动,沉淀出的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并于室温下蒸干乙醇,由胶状逐渐回缩,然后浸人TE中过夜,使其重新吸水膨胀进而和玻璃棒分离。这种方法对操作技术要求较高,但简单快速。
1.3血细胞DNA的快速提取法
采用非离子变性剂NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解细胞,提取细胞核,然后用酚/氯仿抽提DNA。这样从血液中分离获得的DNA纯度高,能够满足各种临床检验和实验的需要。也可采用NP40和Tween-20同时作用破碎细胞膜,以避免SDS对以后步骤的负面作用。Basuni等[‘〕采用了4种常用的从血液中提取DNA的方法:HighPureViralNucleic试剂盒法、QlAamp试剂盒法、Tri-PureTM试剂分离提取法以及经典酚抽提法,对通常作抛弃处理的血凝块进行人DNA及病毒DNA的抽提,发现前两种方法可以迅速高效获得目的DNA,从而建立了由血凝块中提取DNA的方法,扩大了临床检验样本的来源。
1.4玻璃颗粒吸附法
在该法中首先利用含异硫氰酸肌的细胞裂解液裂解细胞,然后加人含有能够与DNA结合的玻璃颗粒的缓冲液,经沉淀收集结合染色体DNA的玻璃颗粒,利用洗脱液进行洗脱获得DNA。不仅玻璃颗粒可以与DNA进行结合,一定大小的硅胶颗粒也可以与DNA进行结合,据此,不少实验工作者实践了很多利用颗粒结合DNA的提取方法。Pichler等[2〕在从抹香鲸(Physetermacrocephalus)牙齿及骨骼中抽提DNA时采用了一种以二氧化硅为吸附介质的方法,从抹香鲸标本骨骼组织中钻取的少量粉末中获得了足够用于分析的DNA产物,此方法扩大了对稀有哺乳动物DNA研究的取材范围。Caldarelli-stefano等[3〕在从福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织标本中提取DNA时利用小磁珠作为结合核,也获得了理想的纯化DNA。很多试剂公司也依此设计生产了许多颗粒提取试剂盒,Pint。等[4]就探讨了采用Gibc。公司的GlassMAX系统,对福尔马林固定的组织进行DNA提取的具体操作方法,目前这些试剂盒在临床上广为应用,省时省力。
1.5三乙醇胺月桂基硫酸盐(TLS)法
由于常规方法中使用的蛋白酶K的水解条件不好掌握,采用TLS来提取组织、细胞以及外周血DNA可以克服这一弊端。TLS是一种较强的表面活性剂,将其直接作用于细胞或组织匀浆,可迅速溶解细胞膜、核膜,而且蛋白质与其结合后即失去对DNA的结合,进一步的纯化可采用常规方法。
1.6临床病理标本的DNA提
文档评论(0)