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ELISA常见问题和处理

问题

可能原因

解决方法

1、无颜色

试剂孵育的时间没有按说明书操作。

确定生物素化抗体，连接的HRP试剂或链霉亲和素-HRP使用的

时间是否适当。

2、不同试剂盒或不同批号的试剂混用。

重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。

不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。

3、漏加酶

检查操作流程，注意不要漏加

5、HRP酶污染了叠氮钠

使用新配制的试剂，禁含叠氮钠

标准品有问题(若在标本孔中有信号)

按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品

某一容器未洗净,残留灭活酶物质

尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠

使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体

重新确认所选用的试剂

.漏加显色剂A或B

加显色剂后观察一下液面高度

试剂配制/使用有误

将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。

缓冲液污染

配制新新鲜的缓冲液

显色弱

超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。

检查产品的有效期

加入试剂的体积和时间有误

确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。

试剂、样品用前未能平衡

用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右

缩短孵育时间能使实验的信号变弱。

检查孵育的时间。

在温度变化的环境内孵育酶标板。

确定孵育的温度，应避免温度的变化。

使用了被污染的试剂

检查试剂是否被污染。

标准品/标本制备方法不规范

检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。低

温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。样品用NaN3防腐,

抑制了酶的反应

显色底物制备不规范

检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。

检测时间不当

是否在规定的时间内检测。

仪器设定不正确，滤光片不匹配。

仪器是否设定正确，滤光片的使用等。

高背景(本底)

洗涤操作不规范

洗板不充分，使用手工洗板常出现。最好使用洗板机，或使用洗

瓶洗涤。每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若使用洗板机，

应校准并设定足够充满每孔的体积量。板的内侧不应接触设备。检查

每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。在两次洗板之

间加30秒的浸泡。

实验中孵育温度和时间不适当

确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当

酶加量过多

加酶前验看移液器调节量是否准确。检查稀释度，若必要进行效

价测定。

封闭不完全

检查封闭液的计算量；提高封闭时间。

标本或标准品中的干扰物质

做适当的对照

显色剂受光照时间较长,或污染

显色剂A和B应于使用前10分钟从冰箱取出

整批样品放置时间过长,样品污染

样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染

缓冲液污染

制备新鲜的缓冲液

吸头重复使用,未洗净或消毒不完全而用于加酶或显色剂

吸头尽可能一次性使用

太多的信号：全部的板子变成规则的蓝色

不充分的洗涤/洗涤步骤被遗漏-没结合的过氧化物酶仍有残留。

最好使用洗板机充分洗涤检查孔内是否有残留的洗液或加样量是

否准确。

底物溶液混合太早并转成蓝色

应控制底物混合的时机并立即使用

太多的酶结合物

检查稀释度，必要时进行效价测定

封板膜或试剂容器被重复使用，导致HRP残留，使TMB底物产

生非特异蓝色。使用新鲜的封板膜，每步使用不同的试剂容器

缓冲液中污染金属或HRP

制备新鲜缓冲液

高CV值(CV：coefficientofva