真核细胞的培养方法.pdfVIP

真核细胞的培养方法

专利名称：真核细胞的培养方法

技术领域：

本发明涉及在含碳酸氢盐的培养基中培养真核细胞的装置

和方法，所述培养基允许在不直接向该培养基中添加碱的情

况下维持细胞培养物的PH。

背景技术：

用于细胞建库、用于细胞产品的生产例如重组蛋白生产的细

胞培养，受到细胞生长时条件变化的妨碍。虽然不锈钢生物

反应器常被用于细胞生产，然而一次性用品(disposables)

越来越多的在生物制品的制造的所有阶段中使用(Rao等，

2009)。在上游工艺中，相比不锈钢制品，一次性的生物反

应器存在诸多的优势(从减少交叉污染到成本和时间的节省)。

WAVEBioreactor是在生物医药工业中用于重组蛋白生产的

一次性上游技术的一个文献充分记载的实例(Cronin等，

2007；Haldankar等，2006；Ling等，2003Je等，2009)。

由Singh(Singh，1999)所开发的WAVEBioreactor系统包

含预先消毒的、柔性的、一次性的培养室(Cellbag)，CO2-

和/或O2-空气混合控制器，和用于摇动和加热Celling的

气动控制平台。由该平台产生的摇摆(rock)运动在Celling

中提供了混合和气体传递。WAVEBioreactor系统可以进一

步装备以提供在线pH和溶解氧(DO)监控以及实时反馈控制

(Mikola等，2007;Tang等，2007)。然而，对额外设备的需

求以及对专门设计的以容纳PH和DO探测器的袋子的需求，

增加了运营成本和系统的复杂性。另外，在pH控制生物反

应器中为使培养物PH增加到规定的设定点所需要的碱加入，

会增加培养物的摩尔渗透压浓度。取决于生物反应器中摩尔

渗透压浓度增加的程度，在细胞增长和存活力方面的相关衰

减(deZengotita等，2002；Zhu等，2005)可能抵消pH值控

制的优势。另外，如果PH探测器发生故障，由此产生的pH

值混乱可能改变细胞代谢并促进细胞死亡(Miller等，

1988；Osman等，2002)。对于某些细胞培养应用来说严格

的pH值和DO控制不是必须的，诸如，例如在小规模培养系

统如摇瓶和转瓶中用于细胞的维持和扩大的常规细胞传代。

然而，PH值和DO的极值对细胞生长和生存力是不利的(Lin

等，1993；Link等，2004；Miller等，1988；Osman等

2001)，并可影响产品质量(Restelli等2006；Yoon等，

2005)。因此，对于生物制品制造的全阶段，对细胞的生长

条件保持一些控制是极其重要的。研究人员先前证明，在6.

8-7.3的PH值范围内和在10-100%空气饱和度的DO值范围

内的CHO细胞培养是成功的(Link等2004；Restelli等

2006；Trummer等2006；Yoon等2005)。向常规生物反

应器增加功能，如实时pH监测和DO监控控制，将显著增加

生物制品制造中细胞培养的成本和劳动强度。另外，这些功

能的失灵或者故障可导致细胞培养的不可接受的变动和潜

在的损失，这是非常耗费时间和资源的。因此，需要用于培

养真核细胞的改进方法，该方法将无需引入强碱以及无需额

外地进行PH值和DO的监测和实时控制。发明概述本发明提

供了在细胞培养系统中无需加入碱即可维持PH值的装置和

方法。在含碳酸氢盐的细胞培养基中，基于碳酸-碳酸氢盐

缓冲液平衡(反应式1)CO2+HOHH2CO3H++HCO3_pH=pK-log

([CO2]/[HCO3-])，培养基中CO2的量将影响培养基的pH

值。因此，本发明利用这种关系，通过使用细胞培养体系中

液相和气相的动态界面来增加或者减少溶解的CO2浓度，无

需添加强酸或者碱，调整细胞培养基的PH值。本发明提供

了一种用于实现此调节的方法和用于实施该方法的装置。一

般地，向本发明的装置供给空气、氧气或者这些气体的组合，

以维持细胞培养物的溶解氧。通过向装置的顶部空间提供气

体混合物(可以操控其组成和引入速度)，取决于液相和气相

之间不同的CO2浓度，CO2可以被加入细胞培养基也可以从

中移除。从顶部空间除去CO2将增加培养PH值，这是因为

培养基中的溶解CO2会扩散进入到顶部空间中。相反，当以

高于培养基中的浓度向所述装置添加CO2时，CO2