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用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒的制作方法

专利名称：用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物及试剂盒的制作

方法

技术领域：

本发明涉及动物医学领域，具体涉及用于鉴别鸭瘟病毒的引

物组合物及试剂盒。

背景技术：

鸭痕病毒(DuckEnteritisVirus)是引起鸭痕(DuckPlague)

的病原,属于一种疱疹病毒，能感染48种以上的雁形目的家

禽和野生禽类。鸭瘟，又称鸭病毒性肠炎，是一种急性传染

病，其发病率和病死率可达100%，鸭瘟的病变包括血管损伤，

胃肠道粘膜的进行性变化，淋巴器官病变和实质性器官的退

行性变化。接种鸭瘟弱毒疫苗是控制该病的有效方法。鸭瘟

病毒能在三叉神经节形成持续性感染。鸭瘟病毒的诊断方法

有病毒中和试验(NT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和PCR试

验等。NT、ELISA和普通的PCR方法只能诊断是否是鸭瘟病

毒，但无法鉴别鸭瘟病毒是强毒株还是弱毒株。公开的发明

专利“一种鉴别鸭瘟病毒强毒与疫苗毒的PCR检测方法”(申

请号:201210116719.2)，通过UL2基因差异区分鸭瘟病毒强、

弱毒株，但此方法仅能鉴别鸭瘟病毒是强毒还是弱毒，而无

法鉴别鸭瘟病毒是欧洲源的强毒，还是中国源的强毒，也无

法鉴别是中国的疫苗毒(弱毒)的VAC株或是Clone-03株。

发明内容

本发明的目的是提供用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，特异

性强，能够鉴别样品是否感染鸭瘟病毒；如果样品感染鸭瘟

病毒，究竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株(弱毒

株)VAC株还是中国疫苗株(弱毒株)Clone-03株。本发明的

另一目的是提供用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，能够鉴别样品

是否感染鸭瘟病毒；如果样品感染鸭瘟病毒，究竟是欧洲强

毒株、中国强毒株、中国疫苗株(弱毒株)VAC株还是中国疫

苗株(弱毒株)Clone-03株。本发明的再一目的是提供上述引

物组合物的应用。用于鉴别鸭瘟病毒的引物组合物，由上游

引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的序列分别

如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。所述上游和下游引物的

浓度为0.01mol/mlo用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒，包括所述

引物组合物、PCR缓冲液、dNTPs和ExTaq酶。所述dNTPs

为dATP、dTTP,dGTP和dCTP的等浓度混合物，所述dATP、

dTTP,dGTP或dCTP的浓度均为2.5Mm。所述弓I物组合物在

制备用于鉴别鸭瘟病毒的试剂盒中的应用。一种应用所述引

物组合物鉴别鸭瘟病毒的方法:

(1)提取待检样品的DNA；

(2)以步骤(I)中所述DNA为模板，用权利要求1或2所述

引物组合物为引物，进行PCR扩增反应，获得PCR产物；

(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断所述PCR产物的

长度；当PCR产物长度为4430-4460bp时，待检样品感染中

国来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物长度为3260-3290bp

时，待检样品感染欧洲来源的鸭瘟病毒强毒株；当PCR产物

长度为920_950bp，待检样品感染中国来源的鸭瘟病毒VAC

株；当PCR产物长度为2510-2540bp，待检样品感染中国来

源的鸭瘟病毒Clone-03。所述中国来源的鸭瘟病毒强毒株为

鸭瘟病毒LH2011株和CHv株中的一种或两种；所述欧洲来

源的鸭瘟病毒强毒株为鸭瘟病毒Jansen、Holland、

Dll-JW-016和v2085株中的一种或两种以上。步骤(2)中PCR

扩增反应的条件为:94°C预变性3min;94°C变性30sec，

52°C退火40sec，72°C延伸3min40sec，循环40次；最

后72°C延伸IOmin0本发明提供的引物组合物或试剂盒，

能够鉴别样品是否感染了鸭瘟病毒；如果感染鸭瘟病毒，究

竟是欧洲强毒株、中国强毒株、中国疫苗株(弱毒株)VAC株

还是中国疫苗株(弱毒株)Clone-03株。采用本发明的引物组

合物或试剂盒鉴别鸭瘟病毒，快速、简便，特异性和敏感性

强，而且成本低廉。适用于临床诊断，科学研究，疫苗生产

和出入境检测等，应用前景广阔。

:

图1为不同毒株鸭瘟病毒的LORFll等位基因序列的比较。

图中Jansen、Holland、Dll-Jff-016和v2085株是欧洲鸭

瘟强毒株，LH2011和CHv株是中国鸭瘟强毒株