柱子、流动相注意事项.pdf

HPLC使用注意事项及HPLC柱子使用经验之谈

HPLC使用注意事项

1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um

或更细的膜过滤)。

2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或

甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用

去离子水冲洗20ml以上。

5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用

有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗

方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。

9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。

更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状可能的原因解决方法

一()保留时间变化

柱温1.变化柱恒温，必要时需配置恒温箱

等2.度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

缓冲液3.容量不够用》25mmol/L的缓冲液

柱4.污染每天冲洗柱

柱5.内条件变化稳定进样条件,调节流动相

柱6.快达到寿命采用保护柱

二()保留时间缩短

流1.速增加检查泵,重新设定流速

样品超2.载降低样品量

键合3.相流失流动相PH值值保保持在持在检查柱的方向

流动相4.组成变化防止流动相蒸发或沉淀

温5.度增加柱恒温

三()保留时间延长

流1.速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡

硅胶2.柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化

键合3.相流失同前(二)3

流动相4.组成变化同前(二)4

5.温度降低同前(二)5

(四)出现肩峰或分*

样品1.体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%

样品溶剂过2.强采用较弱的样品溶剂

柱塌陷或形成短路通道3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件

柱内烧结不锈钢失效4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品

进样器损坏5.更换进样器转子

五()鬼峰

进样阀残余峰1.每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗

样品中未知物2.处理样品

柱未平衡3.重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)

三氟乙酸4.(TFA)氧化(肽谱)每天新配,用抗氧化剂

水污染5.(反相)通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水

六()基线噪声

气泡1.(尖锐峰)流动相脱气,加柱后背压

污染2.(随机噪声)清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂

检测器灯连续噪声3.更换氘灯

电干扰4.(偶然噪声)采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)

检测器中5.有气泡流动相脱气,加柱后背压

七()峰拖尾

柱1.超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相

峰干扰2.清洁样品,调整流动相

硅羟3.基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品

同前4.(四)4同前(四)4

同前5.(四)35.同前(四)3

死体积6.或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的

连接管

柱效7.下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱

八()峰展宽

进样1.体积过大同(四)1

在进样阀中2.造成峰扩