细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座.pptxVIP

细胞生物学试验张伟1.细胞培养中为何NaHCO3？2.细胞培养中为何添加血清？3.消化液胰酶浓度是多少？细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第1页

细胞生物学试验张伟一、试验原理（一）传代培养1.传代培养概念当原代培养细胞或已成为细胞系细胞，增殖到达一定密度后，将培养细胞从一个容器以适当比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，称为传代培养或继代培养。细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第2页

细胞生物学试验张伟2.细胞传代意义与目标预防细胞增殖过分、营养枯竭、酸中毒维持细胞种延续。利用培养细胞进行各种试验。细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第3页

细胞生物学试验张伟传代中“代”与细胞世代中“代”不一样传代频率或间隔与培养液性质、接种细胞数量和细胞增殖速度相关。3.需要注意两个问题细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第4页

细胞生物学试验张伟（二）培养细胞种类贴壁细胞：附着在一个固相支持物表面才能生长细胞。如大部分上皮起源细胞。单层细胞，接触抑制。半贴壁细胞：展现贴壁生长现象，但不牢。悬浮细胞：不需附着在固相支持物表面，悬浮即可生长细胞。如血细胞等。细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第5页

细胞生物学试验张伟贴壁细胞细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第6页

细胞生物学试验张伟细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第7页

细胞生物学试验张伟悬浮型细胞。细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第8页

细胞生物学试验张伟半贴壁细胞细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第9页

细胞生物学试验张伟（三）细胞贴壁过程细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第10页

细胞生物学试验张伟（四）细胞传代后四个生长阶段潜伏期：细胞无分裂，6-二十四小时。指数生长久：细胞增殖最旺盛时期，分裂相细胞百分比（分裂指数）。停滞期：细胞数量到达饱和，细胞停顿增殖，但仍有代谢活动。平台期。衰退期：自然衰退和耗竭衰退。细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第11页

细胞生物学试验张伟培养细胞一代生长过程细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第12页

细胞生物学试验张伟（五）何时传代与怎样传代？

1.肉眼观察——培养物颜色及混浊度细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第13页

细胞生物学试验张伟2.倒置显微镜观察细胞生长状态细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第14页

细胞生物学试验张伟贴壁生长细胞传代

弃掉培养液，加0.5～1mL胰酶涮洗一下培养瓶，去残留旧培养液，解除血清对胰酶抑制作用。每瓶细胞加入1mL胰酶,盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞突起收回变圆时马上翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶去掉。注意勿使细胞提早脱壁落入消化液中。加入5ml含血清新鲜培养基，重复吹打消化好细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液计数然后分装到新培养瓶中(1x105/ml，5mL/小瓶）。盖上瓶盖,适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体进入，将培养瓶放回CO2培养箱。细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第15页

细胞生物学试验张伟细胞消化最正确程度细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第16页

细胞生物学试验张伟悬浮细胞传代步骤可将细胞培养悬液进行离心去除旧培养液上清，加入新鲜培养液，然后分装到各瓶中。细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第17页

细胞生物学试验张伟意义：为了保留细胞，尤其是不易取得突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存（保种）。运输等条件：冻存温度普通用液氮温度－196℃，短时间能够存放在-80℃。冻存液：普通为含10%二甲亚砜（DMSO）或甘油培养基(六)细胞冻存细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座第18页

细胞生物学试验张伟冷冻保护剂种类及作用机制惯用渗透性冷冻保护剂主要包含甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。DMSO：对细胞无毒性，分子量小，溶解度好，能快速透入细胞，降低冰点，提升细胞膜对水通透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提升细胞内电解质浓度，降低胞内冰晶，从而降低