细胞基因组DNA的提取.pptxVIP

试验一细胞基因组DNA提取;分离纯化核酸总标准：

①应确保核酸一级结构完整性；

②排除其它分子污染。

核酸纯化应到达要求：

①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用有机溶剂和过高浓度金属离子；

②其它生物大分子污染应降低到最低程度；

③排除其它核酸分子污染。;核酸制备时应注意事项:

①尽可能简化操作步骤，缩短提取过程。

②降低化学原因对核酸降解。

③降低物理原因对核酸降解：机械剪切力和高温

④预防核酸生物降解。;核酸制备步骤：

;核酸酶抑制和抑制剂

降低温度，改变pH及盐浓度，都利于对核酸酶活性抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更加好。

对于DNA，抑制DNase活力很轻易，但预防机械张力拉断则更主要。

对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更主要。;核酸酶抑制和抑制剂

DNase抑制

①加入少许金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本能够全部失活。

②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。;核酸酶抑制和抑制剂

RNase抑制

①操作要带手套。

②全部器皿要严格消毒，

③试剂处理

④低温操作

⑤在分离过程中要加入一定RNase抑制剂。;核酸制备中惯用去垢剂

核酸本身带负电荷，结合带正电荷蛋白质。用于核酸提取去垢剂，普通都是阴离子去垢剂，去垢剂作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；

2．溶解核糖体上面蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；

3．对RNase、DNase有一定抑制作用。;核酸制备中惯用蛋白质变性剂

蛋白质变性剂作用：

1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。

2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。

3.一些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞作用。

;核酸制备中惯用酶

DNase

RNase

蛋白酶K

溶菌酶

;核酸提取普通过程

1）破碎细胞（预防核酸??作用）

微生物：溶菌酶、SDS裂解。

高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。

酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，

冰冻法：重复冻融或液氮冻后组织捣碎。

动物：液氮处理后用匀浆器破碎。

细胞器DNA：首先纯化细胞器。

以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂;核酸提取普通过程

2）破碎抽提核酸除去杂质

1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒核蛋白与其它成份分离

2．使核酸与蛋白质分离

3．除去脂类

4．多糖除去;核酸提取普通过程

3）核酸纯化

依据所需核酸性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最终得到均一核酸样品。

;4）核酸样品保留

核酸保留主要条件是温度和介质

温度：

4℃（5℃）最正确和最简单

-70℃是长久保留良好温度，为一次性保留

-20℃保留

保留介质：

TE缓冲溶液(最惯用)

10mmol/LTris-ClpH8.0

1mmol/LEDTApH8.0;试验目标;材料与试剂;试验操作与注意事项;;;四、注意事项——材料准备;四、注意事项——细胞裂解;四、注意事项——核酸分离、纯化;四、注意事项——核酸沉淀、溶解;

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