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中华人民共和国国家标准

GBxxxx—xxxx

食品安全国家标准

动物性水产品中华支睾吸虫的检验

（征求意见稿）

xxxx-xx-xx发布xxxx-xx-xx实施

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食品安全国家标准

动物性水产品中华支睾吸虫的检验

1范围

本标准规定了即食生制动物性水产制品中华支睾吸虫(Clonorchissinensis）囊蚴的形态学和PCR检

验方法。

本标准适用于即食生制动物性水产制品中华支睾吸虫囊蚴的检验。

2原理

动物性水产制品中的华支睾吸虫囊蚴主要寄生于淡水鱼和淡水虾的肌肉组织。用胃蛋白酶消化动

物性水产制品的肌肉组织获得囊蚴。根据囊蚴的形态特征，初步判断囊蚴的种类。通过扩增华支睾吸

虫核糖体DNA第二内转录间隔区（ITS-2）基因片段并测序，进行华支睾吸虫囊蚴的鉴定。

3仪器和设备

3.1生物显微镜：100×～400×。

3.2体视显微镜：7.5×～150×。

3.3PCR扩增仪。

3.4凝胶成像系统。

3.5电泳仪。

3.6恒温培养箱：37℃±1℃。

3.7高速离心机：转速≥12000r/min。

3.8网筛：孔径0.25mm（60目）。

3.9锥形量杯：1000mL。

3.10微量移液器：0.2μL～2.5μL，1μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL。

4试剂和材料

4.1试剂

4.1.1盐酸：36%～38%HCl溶液。

4.1.2生理盐水：0.85%NaCl溶液。

4.1.31mol/LTris-HCl溶液（pH8.0）。

4.1.40.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）。

4.1.510%SDS溶液。

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4.1.65mol/LNaCl溶液。

4.1.73000U/mg胃蛋白酶。

4.1.820mg/mL蛋白酶K。

4.1.9苯酚/三氯甲烷/异戊醇（25:24:1）。

4.1.105U/μL耐热DNA聚合酶。

4.1.1110×PCR缓冲液。

4.1.1225mmol/LMgCl。

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4.1.13dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGTP，每种浓度为2.5mmol/L。

4.1.14琼脂糖：电泳级。

4.1.1550×TAE缓冲液：使用前用去离子水稀释成1×TAE缓冲液。

4.1.161×TE溶液（pH8.0）。

4.1.1710mg/mL溴化乙锭（EB）或其他核酸染料。

4.1.186×上样缓冲液。

4.1.19100bp～2000bpDNA分子量标准。

4.1.20PCR引物：浓度为20μmol/L。

正向引物CS1：5’-CGAGGGTCGGCTTATAAAC-3’

反向引物CS2：5’-GGAAAGTTAAGCACCGACC-3’

扩增华支睾吸虫ITS-2基因片段长度为315bp。

4.2试剂配制

4.2.1胃蛋白酶消化液：取胃蛋白酶5g，溶解于900mL生理盐水中，加盐酸7mL，混匀，再加生理

盐水至1000mL，临用现配。

4.2.2裂解液：10%SDS溶液100mL、1mol/LTris-HCl溶液10mL、0.5mol/LEDTA溶液200mL、5

mo