幽门螺旋杆菌的激活培养与保存条件-2019年精选文档.pdfVIP

幽门螺旋杆菌的激活培养与保存条件

幽门螺旋杆菌(HP)是一种弯曲状的革兰氏阴性杆菌，与消化

疾病的关系现已被国内外大量研究所证明：HP是胃炎、消化性

溃疡的最主要致病因素。如何根除HP所致的消化系统疾病已成

为消化界学者关注的热点。为了完成基金项目蜂胶左金胃三联抗

幽门螺旋杆菌临床与实验研究，首先遇到的是HP的培养保存的

问题，由于HP的生物特性所决定其生长条件要求非常高，培养

过程十分复杂、杂菌生长多，给研究HP带来很大困难，本文主

要研究了不同培养基条件对HP生长的影响，探讨并优选出最佳

的培养条件，保存方法，为下一步蜂胶左金胃三联抗HP的体外

抑菌实验、血清药理实验、药敏等试验做好前期准备。

1材料

微需氧培养罐(昆明玻璃厂制)、恒温培养箱、超净化工作台、

混合气体(85％N2、10％CO2、5％O2)(昆明天贝特种气体XX公

司)、温度湿度表(天津风洋仪器仪表工贸公司)、幽门螺旋杆菌

菌株(北京疾控中心)、哥伦比亚琼脂、脑心浸液琼脂(中国进出

口商品检验技术研究所、北京陆桥技术有限责任公司)、万古霉

素(批号0319，BieSharp公司)、多粘霉素(批号0990，BioSharp

公司)、两性霉素(批号E437，XIASIBIO公司)、甲氧氨苄嘧啶(批

号06121.RESEARCHORGANICS公司)乳酸(上海试剂一厂)、氧化

酶、尿素酶(杭州天和微生物试剂XX公司)、新生牛血清、羊血

清(杭州四季青生物工程材料XX公司)、羊全血(昆明医学院动物

中心)。

2方法

2．1混合抗生素的配制

精密称取万古霉素0.016g，两性霉素B0.016g，多粘菌素

0.0006g，将此3种抗生素在紫外线下照射1h，均匀混合。精

密称取甲氧苄胺嘧啶0.008g，溶于10mL蒸馏水，并加乳酸一滴，

煮沸10min，之后无菌加入以上混合抗生素中，用灭菌蒸馏水加

至40mL，混匀，4℃保存备用。

2．2固体培养基的配制

2．2．1正交试验法筛选固体培养基条件选用混合因素

正交表进行实验，以血样、琼脂、混合抗生素、pH值为考察因

素，以综合评分为考察指标。

2．2．2按照因素水平表配制固体培养基量取哥伦比亚

琼脂15mL待温度降至45－50℃时加入羊全血0.8mL，调pH值为

7.5，混合均匀后快速浇板备用。量取哥伦比亚琼脂15mL待温度

降至45－50℃时加入羊血清0.8mL和混合抗生素0.4mL，调pH

值为8.5，混合均匀后快速浇板备用。取哥伦比亚琼脂15mL待

温度降至45－50℃时加入牛血清0.8mL，调pH值为8.5，混合

均匀后快速浇板备用。取脑心浸液琼脂15mL待温度降至45－

50℃时加入羊全血0.8mL和混合抗生素0.4mL，调pH值为8.5

混合均匀后快速浇板备用。取哥伦比亚琼脂15mL待温度降至45

－50℃时加入羊血清0.8mL和混合抗生素0.4mL，调pH值调到

7.5，混合均匀后快速浇板备用。取哥伦比亚琼脂15mL待温度降

至45－50℃时入羊全血0.8mL和混合抗生素0.4mL，调pH值调

到6.5，混合均匀后快速浇板备用。从4号三角瓶中量取脑心浸

液琼脂15mL待温度降至45－50℃时加入羊血清0.8mL，调pH值

调到6.5，混合均匀后快速浇板备用。取哥伦比亚琼脂15mL待

温度降至45－50℃时加入牛血清0.8mL和混合抗生素0.4mL，调

pH值调到6.5，混合均匀后快速浇板备用。取脑心浸液琼脂15mL

待温度降至45－50℃时加入牛血清0.8mL和混合抗生素0.4mL，

调pH值调到7.5，混合均匀后快速浇板备用。

2．3HP培养

将固体培养基制备好后，用L棒在上述各固体培养基上涂菌

液，放入培养罐中，充气10min，温度37℃，湿度90％以上，

培养72h。

3HP鉴定实验

3．1菌落形态

培养器皿平板上的HP菌落呈针尖样，毛玻璃样半透明湿润。

3．2涂片镜检

方法：用生理盐水1滴，滴在干净载玻片上，用接种环刮取

少许HP菌落在生理盐水中并涂开。将涂片烘干后进行常规革兰

染色，在显微镜下观察，见紫红色短杆状。

3．3氧化酶试验

方法：刮取细菌放置在浸有氧化酶试剂的滤纸上，在接触部

位出现深